基于GelMA的3D生物打印技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用

夏培斌，余劉洋，王超威，閆立論，劉志遠(yuǎn)，張 鐳，程 杰，崔景強(qiáng)

（1.河南省醫(yī)用高分子材料技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453400；2.河南省駝人醫(yī)療科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453400；3.甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)所，甘肅 蘭州 730070）

3D生物打印技術(shù)是生物制造、增材制造、組織工程和再生醫(yī)學(xué)融合的產(chǎn)物。利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件（CAD），將含活細(xì)胞的生物材料（生物墨水）連續(xù)堆疊和組裝，從而設(shè)計(jì)出一個(gè)有活性的三維結(jié)構(gòu)。該技術(shù)旨在人工開發(fā)活體組織和器官的替代品，用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)研究[1]。

一種理想的生物墨水應(yīng)該具有目標(biāo)組織的適當(dāng)?shù)臋C(jī)械、流變和生物特性，這對(duì)確保生物打印組織和器官的正確功能至關(guān)重要。GelMA由于其具有的可調(diào)節(jié)機(jī)械性能、良好的生物相容性、原位光聚合能力以及可打印性，越來越被人們認(rèn)為是一種重要的生物墨水材料[2]。GelMA合成最早是由BULCKE等報(bào)道的，GelMA是一種基于明膠的工程材料，已被證明可用于組織工程、藥物輸送、細(xì)胞培養(yǎng)和3D打印等領(lǐng)域[3]。

近幾年，基于GelMA水凝膠的生物墨水在3D生物打印技術(shù)中被大量研究，這些研究主要集中于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本文總結(jié)了3D生物打印技術(shù)的原理、GelMA的合成和表征以及GelMA在3D生物打印技術(shù)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用，以期為基于GelMA的3D生物打印技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 3 D生物打印技術(shù)

組織工程的成功主要依賴于構(gòu)建復(fù)雜、充滿細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)能力，這些結(jié)構(gòu)與原始的活組織非常相似。因此，設(shè)計(jì)和創(chuàng)建生物材料支架的結(jié)構(gòu)和地形的策略是功能性組織工程的一個(gè)重要方面。根據(jù)工作原理，3D生物打印技術(shù)可分為3種，即噴墨生物打印、激光輔助生物打印、擠壓生物打印。這些生物打印策略可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用，以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的目標(biāo)和組織制造。

1.1 噴墨打印

噴墨生物打印與傳統(tǒng)的2D噴墨打印非常相似。將生物墨水儲(chǔ)存在墨盒中，然后將該墨盒連接到打印機(jī)頭，并在電子控制的打印過程中充當(dāng)生物墨水源。在打印過程中，通過熱致動(dòng)器或壓電致動(dòng)器使打印頭變形并擠壓產(chǎn)生可控制大小的液滴，如圖1（a）所示。噴墨打印的優(yōu)勢(shì)為構(gòu)造簡(jiǎn)單、成本低、打印速度快、有較高細(xì)胞生存能力（通常從80%到90%）。缺點(diǎn)也相當(dāng)明顯，如高黏度的材料或高密度的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致噴頭堵塞。

1.2 激光輔助打印

這種生物打印策略源于激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移（LIFT）效應(yīng)，以精確和微米分辨率打印不同的活細(xì)胞和生物材料。激光輔助打印系統(tǒng)的關(guān)鍵部分是響應(yīng)激光刺激的供體層。該供體層為緞帶結(jié)構(gòu)，頂部為吸能層（如鈦或金），底部為懸浮生物墨水溶液層。在印刷過程中，聚焦的激光脈沖用于刺激吸收層的一小片區(qū)域。激光脈沖使部分供體層汽化，在生物墨水層的界面產(chǎn)生高壓氣泡，推動(dòng)懸浮生物墨水[4]。下落的生物液滴被收集到接收底物上，然后交聯(lián)，如圖1（b）所示。與噴墨打印相比，激光輔助打印可以避免分配器與生物墨水之間的直接接觸。這種非接觸式打印方法不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械壓力，因此細(xì)胞存活率高通常高于95%。此外，激光輔助打印可以打印高黏性材料。缺點(diǎn)是成本較高，同時(shí)由于激光源的存在通常使這類打印機(jī)比較笨重和復(fù)雜。

1.3 擠壓打印

擠壓打印是噴墨印刷的一種改進(jìn)。為了打印噴墨打印機(jī)無法沉積的黏性材料，擠出打印使用空氣泵或機(jī)械螺桿柱塞來分配生物墨水，如圖1（c）所示。通過施加一個(gè)連續(xù)的力，擠壓印刷可以打印不間斷的圓柱線，而不是單一的生物墨水滴。幾乎所有類型的不同黏度的水凝膠預(yù)聚合物溶液以及細(xì)胞密度高的聚集物都可以用擠壓生物打印機(jī)打印。

圖1 3D生物打印技術(shù)原理圖[4]

2 GelMA的合成

制備GelMA的方法，都是基于BULCKE等首次報(bào)道的一般方法的微小變化。合成方法如下[5]：將明膠加入至PBS中，50℃攪拌至完全溶解，然后以一定的速率加入MA，反應(yīng)3 h?；旌先芤河肞BS稀釋以停止反應(yīng)，通過透析5～7 d，完全去除具有潛在細(xì)胞毒性的低分子量雜質(zhì)。最后，將透析液冷凍干燥后冷藏待用。

3 GelMA生物墨水表征

生物墨水在生物打印中扮演著重要的角色。它們不僅與細(xì)胞直接接觸以提供結(jié)構(gòu)支持，而且還支配著生物墨水的化學(xué)和物理特性。理想情況下，用于生物打印的水凝膠應(yīng)該具有如下特性。

3.1 可打印性和可交聯(lián)性

可打印性指生物墨水和基質(zhì)之間的關(guān)系，可以打印出準(zhǔn)確、高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)。在生物打印中，可打印性通常與表面張力有關(guān)。生物墨水經(jīng)加壓后，只有快速交聯(lián)才能保證打印結(jié)構(gòu)的保真性。

3.2 機(jī)械性能

水凝膠應(yīng)在聚合后保持足夠的機(jī)械性能，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的附著、增殖和分化環(huán)境[6]。這些力學(xué)性能包括應(yīng)變、剪切應(yīng)力、壓縮模量和質(zhì)量膨脹比。

3.3 生物相容性

生物相容性指材料在特定情況下與宿主發(fā)生適當(dāng)反應(yīng)的能力。生物相容性要求材料本身對(duì)細(xì)胞增殖無害，并具有提供與細(xì)胞適當(dāng)結(jié)合的能力。同時(shí)要求材料可以被細(xì)胞降解或與細(xì)胞融合，而不會(huì)產(chǎn)生有害的副產(chǎn)品或與細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面的相互作用。

3.4 降解性

不受控制的快速降解是GelMA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)，組織支架的基本職責(zé)是在整個(gè)結(jié)構(gòu)的預(yù)期使用壽命內(nèi)保持細(xì)胞增殖和所需的細(xì)胞分布。因此在設(shè)計(jì)生物墨水時(shí)，一個(gè)重要的考慮因素是支架在生物降解和愈合過程中的功能依賴性在支架和新生組織之間的轉(zhuǎn)變。

4 3D生物打印技術(shù)應(yīng)用

本部分從幾種常見的組織類型等方面綜述了3D生物打印技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀。

4.1 血管

傳統(tǒng)的微加工技術(shù)無法創(chuàng)建復(fù)雜的多尺度結(jié)構(gòu)，如血管內(nèi)皮與周圍結(jié)締組織和薄壁細(xì)胞之間的界面，3D生物打印技術(shù)可能解決這個(gè)問題。例如TURNER等[7]設(shè)計(jì)了一種定制的細(xì)胞響應(yīng)型生物墨水，該墨水由GelMA外殼包裹著肽功能化的細(xì)胞負(fù)載的琥珀酰殼聚糖/葡聚糖醛核心，成功地進(jìn)行了生物打印，結(jié)果產(chǎn)生了有組織的微設(shè)計(jì)，顯示出出色的細(xì)胞活力及隨后血管形成。XU等[8]在GelMA中添加透明質(zhì)酸、甘油和明膠，形成具有良好打印性、機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性的生物墨水，利用三維微擠壓生物打印機(jī)在固體平臺(tái)上一步制備出一種小直徑、異質(zhì)雙分子層血管樣結(jié)構(gòu)，與天然血管高度相似，保持了較高的細(xì)胞存活率和增殖能力。

4.2 軟骨

迄今為止，關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療仍然具有挑戰(zhàn)性?；旌仙锎蛴〗Y(jié)合了發(fā)育生物學(xué)、生物材料科學(xué)和3D生物打印的原理，是發(fā)展新的再生療法的一個(gè)有前途的策略。在這種方法中，使用小直徑的無支架軟骨微組織作為構(gòu)建塊，與光交聯(lián)水凝膠結(jié)合，然后進(jìn)行生物打印。ZHOU等[9]利用GelMA和聚二丙烯酸酯打印3層梯度支架，涂上賴氨酸功能化玫瑰形納米管，以改善脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化。結(jié)果表明可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增值分化，軟骨形成良好。MU等[10]從人體脂肪組織分離脂肪干細(xì)胞（hADSCs），取第3代細(xì)胞與GelMA水凝膠和光引發(fā)劑混勻制成生物墨水，然后采用3D生物打印技術(shù)制備出hADSCs-GelMA復(fù)合支架。對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果表明復(fù)合支架具備穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞存活率高，可在體內(nèi)、外誘導(dǎo)分化為軟骨組織，可用于體內(nèi)外構(gòu)建組織工程軟骨。以上研究為應(yīng)用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨提供了一定的思路和研究基礎(chǔ)。

4.3 皮膚

現(xiàn)在，利用3D生物打印技術(shù)可以模擬和制造出人體最大、最復(fù)雜的多層器官，即皮膚。3D打印皮膚具有巨大的潛力，可用于傷口愈合、燒傷皮膚置換以及用于產(chǎn)品和藥物測(cè)試的體外人體皮膚模型。ZHOU等[11]研究利用基于GelMA的仿生生物墨水結(jié)合數(shù)字光處理的3D打印技術(shù)，成功打印出一種功能活性皮膚，具有相互連接的微通道，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和新組織的形成。體內(nèi)研究表明，活體皮膚具有即時(shí)防御功能，在促進(jìn)大型動(dòng)物皮膚附肢真皮再生方面具有優(yōu)越的表現(xiàn)。JIN等[12]利用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和GelMA生物墨水，成功打印出一種功能皮膚模型（FSM）。研究表明FSM不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，還能支持體外表皮重建。在體內(nèi)移植后，F(xiàn)SM可維持細(xì)胞活力至少1周。此外，F(xiàn)SM促進(jìn)創(chuàng)面愈合和上皮再生，刺激真皮ECM分泌和血管生成，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

5 結(jié)語(yǔ)

生物打印技術(shù)是一種先進(jìn)的基于生物墨水負(fù)載細(xì)胞的技術(shù)，具有廣闊的發(fā)展前景，同時(shí)也面臨許多挑戰(zhàn)和問題。由于生物打印在微尺度、高通量、細(xì)胞沉積等方面的優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用正在迅速擴(kuò)大。基于GelMA的3D生物打印技術(shù)已成為一種強(qiáng)大的制造工具，以創(chuàng)建復(fù)雜的微觀和宏觀尺度生物醫(yī)學(xué)系統(tǒng)。即使已經(jīng)取得了這些進(jìn)展，生物打印仍然是一項(xiàng)具有驚人潛力的新興技術(shù)。