貝萊斯芽孢桿菌EBV02 對棉花黃萎病的防治作用及機理

白紅燕，趙麗紅，蒲丹丹，馮自力，魏鋒，馮鴻杰，顧愛星，朱荷琴，彭軍,3*，張亞林*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/ 教育部棉花工程研究中心，烏魯木齊 830052；3. 三亞中國農(nóng)業(yè)科學院國家南繁研究院，海南 三亞 572024）

棉花（Gossypiumspp.）是重要的天然纖維作物，作為戰(zhàn)略物資來源在國民經(jīng)濟中的地位舉足輕重。 棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.） 引起的一種土傳真菌維管束病害，對棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)造成了巨大損失。 該病原菌能常年存活在土壤中，其寄主范圍極廣，能夠危害多種農(nóng)作物，且容易產(chǎn)生變異。 目前，對黃萎病采取了不同的防治措施， 如選擇抗病品種、輪作倒茬和化學防治等，但防治效果不理想。 因此，亟需找到一種對環(huán)境友好且有效的防治方法，生物防治以綠色環(huán)保、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢被人們關(guān)注并且應(yīng)用于實踐中。 目前，用于防治病害的拮抗微生物有細菌、真菌、放線菌等，其主要通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance,ISR），進一步爭奪養(yǎng)分和定植空間，或通過產(chǎn)生植物激素和提供營養(yǎng)物質(zhì)抑制病原侵染、促進植物生長[1]。生防細菌作為生防微生物重要的類群，在病害防治中發(fā)揮重要作用， 其中以芽孢桿菌（Bacillussp.）應(yīng)用較多，如枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、 地衣芽孢桿菌 （B.licheniformis）等。貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）作為芽孢桿菌屬的一個新種，在自然界中廣泛分布，對人畜無害，對環(huán)境無污染，并且能產(chǎn)生對多種病原微生物有拮抗作用的次生代謝物[2]。Martínez-Raudales等[3]發(fā)現(xiàn)，B.velezensis2A-2B 能夠顯著抑制辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、立枯絲核菌 （Rhizoctonia solani） 的生長， 抑制率均在60%以上。此外，貝萊斯芽孢桿菌對一些植物病原細菌也具有較強的拮抗活性。 Cui 等[4]從馬鈴薯（Solanum tuberosum） 塊莖中分離到的貝萊斯芽孢桿菌8-4， 對引起馬鈴薯瘡痂病的鏈霉菌（Streptomyces galilaeus）具有較強的抑菌活性；田間試驗結(jié)果顯示，該菌不僅能夠有效控制馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病率， 還能夠顯著提高馬鈴薯的產(chǎn)量。 可見，貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)病害防治方面有較好應(yīng)用前景。

前期，本團隊從健康棉花植株內(nèi)篩選出一株對棉花黃萎病菌具有拮抗效果的內(nèi)生細菌菌株EBV02。 本研究以該菌株為對象，經(jīng)菌種鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，進一步分析該菌株對棉花黃萎病菌菌絲生長、 產(chǎn)孢量和微菌核萌發(fā)的影響，以及對棉花的誘導(dǎo)抗性，以期探明該菌株防治棉花黃萎病的作用機理，從而為研發(fā)可用于田間防治棉花黃萎病的微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試內(nèi)生細菌菌株：EBV02， 來自中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所棉花病害課題組建立的棉花生防菌種群資源庫[5-6]；黃萎病菌菌株為大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080[7]，棉花品種為耐黃萎病品種魯棉研21 號[8]，均由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所棉花病害課題組提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）固體培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基、盧里亞- 貝爾塔尼（Luria-Bertani, LB）固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基。

1.2 形態(tài)觀察和分子生物學鑒定

形態(tài)觀察和生理生化試驗參照汪靜杰等[9]的方法。 利用Bacterial DNA Kit 試劑盒（Omega 公司）提取EBV02 的基因組DNA，利用16S 核糖體DNA（ribosomal DNA, rDNA）的通用引物1492R 和27F，以50 μL 體系（DNA 1 μL）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送至上海派森諾生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）16S rDNA 數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，選出同源性最高且已公布的典型菌株序列， 采用Mega 7 的鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所選模型為Kimura 兩參數(shù)模型， 自展法（Bootstrap）參數(shù)（抽樣次數(shù)）設(shè)置為1 000。

1.3 EBV02 對大麗輪枝菌拮抗作用的檢測

1.3.1對峙培養(yǎng)法測定EBV02 對V.dahliae 菌絲生長的影響。 EBV02 培養(yǎng)液的制備：將篩選到的貝萊斯芽孢桿菌EBV02 在LB 固體培養(yǎng)基上進行活化，選擇單菌落接到LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，獲得貝萊斯芽孢桿菌培養(yǎng)液備用（600 nm 波長處的吸光值為0.8）。 在PDA 固體培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的Vd080 菌餅（直徑5 mm），然后在距離培養(yǎng)基中心20 mm 處對稱放置2 個牛津杯，每杯內(nèi)加入已經(jīng)活化的50 μL 的EBV02 培養(yǎng)液， 以接種Vd080 不加EBV02 培養(yǎng)液作為空白對照， 每個處理重復(fù)5 次。 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察抑菌情況，在第10 天，利用十字交叉法測定Vd080菌落直徑，計算抑制率（I）。 計算公式：I＝[（D1-5）-（D2-5）]/（D1-5）×100%[10]。 式中，D1和D2分別為空白對照和處理的菌落直徑。

1.3.2對扣培養(yǎng)法測定EBV02 對V.dahliae 菌絲生長的影響。 在PDA 固體培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的Vd080 菌餅（直徑5 mm），在LB 固體培養(yǎng)基上接種5 μL 已經(jīng)活化好的EBV02 培養(yǎng)液，將上述2 個培養(yǎng)基對扣密封，以接種Vd080的PDA 培養(yǎng)基和空白LB 對扣培養(yǎng)為空白對照，每個處理重復(fù)5 次。 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。利用十字交叉法測定Vd080 菌落直徑， 采用1.3.1 中公式計算抑制率。

1.3.3混合培養(yǎng)法測定EBV02 培養(yǎng)液對V.dahliae 產(chǎn)孢量的影響。取EBV02 培養(yǎng)液1 mL 與等體積的Vd080 孢子懸浮液（含量為1×107mL-1）混合均勻，置于50 mL 離心管中，以無菌LB 液體培養(yǎng)基與Vd080 孢子懸浮液的等體積混合液為對照， 每個處理重復(fù)5 次， 在25 ℃搖床上培養(yǎng)， 分別在24 h、48 h 和96 h 時借助血球計數(shù)板計算孢子含量[11]。

1.3.4混合培養(yǎng)法測定EBV02 培養(yǎng)液對V.dahliae 微菌核萌發(fā)的影響。微菌核的培養(yǎng)及其懸浮液的制備參照Hu 等[12]的方法。 取100 μL 微菌核懸浮液與等體積的EBV02 培養(yǎng)液、1/2 稀釋液和1/4 稀釋液混合均勻， 置于18 ℃暗培養(yǎng)20 h后鏡檢，檢測其萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率，以微菌核懸浮液與無菌LB 液體培養(yǎng)基的等體積混合液為對照。 每個處理重復(fù)5 次， 每次觀察100 個微菌核。

1.4 EBV02 對棉花生長的影響以及對黃萎病的防治效果

1.4.1EBV02 浸種對棉種萌發(fā)的影響。利用高速離心機收集菌體，菌體洗滌3 次，溶解在5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose sodium,CMC-Na） 溶液中制成原液，再制成1/2 稀釋液和1/4 稀釋液，備用。 將種子消毒后， 取50 粒棉種在原液、1/2 稀釋液和1/4 稀釋液中浸泡12 h，以5%CMC-Na 溶液浸種處理為對照，重復(fù)5 次，25 ℃培養(yǎng)，2 d 后檢測萌發(fā)率和芽長[11]。

1.4.2溫室試驗測定EBV02 對棉花生長的影響以及對黃萎病的防治效果。 浸種法： 將蛭石、沙子、營養(yǎng)土按質(zhì)量比3∶2∶1 混合均勻后裝入紙缽（直徑6 cm，高度10 cm），棉苗培育和Vd080的接種方法參照蛭石沙子無底紙缽定量蘸菌液法[13]。同時，用EBV02 培養(yǎng)液浸泡魯棉研21 號棉種12 h，每個紙缽中播種8 粒棉種，每6 個紙缽為1 個處理，每個處理重復(fù)3 次，以無菌LB 液體培養(yǎng)基浸種作為對照。播種后7 d 進行間苗，每缽保留5 株棉苗。 待1 片真葉初現(xiàn)時，每個紙缽接種Vd080 孢子懸浮液（含量為1×107mL-1）10 mL，跟蹤監(jiān)測棉花長勢情況，適時調(diào)查棉花發(fā)病情況。

灌根法：溫湯（初始溫度55 ℃）浸泡魯棉研21 號棉種12 h，棉苗的播種、定苗參照浸種法。待棉花1 片真葉初現(xiàn)后，用EBV02 培養(yǎng)液灌根，處理后3 d，每個紙缽接種Vd080 孢子懸浮液（含量為1×107mL-1）10 mL，每6 個紙缽為1 個處理，以等體積無菌LB 液體培養(yǎng)基灌根為對照。

接種Vd080 孢子懸浮液后15 d 參照5 級分級標準調(diào)查發(fā)病情況，同時計算病情指數(shù)和防治效果[14-15]。 播種后60 d，每個處理隨機選取15 株棉花測量株高、主根長、鮮物質(zhì)質(zhì)量等生物量指標。棉花黃萎病病情指數(shù)計算公式為DI＝Σ（Ni×i）/（N×4）×100。式中，DI為病情指數(shù)，Ni為各級病株數(shù)，i為病級數(shù)值，N為調(diào)查總株數(shù)。 防治效果（E）計算公式為E（%）＝（DI0-DI1）/DI0×100。式中，DI0為對照病情指數(shù)，DI1為處理病情指數(shù)。

1.4.3大田試驗測定EBV02 對棉花生長的影響以及對黃萎病的防治效果。 在棉花黃萎病發(fā)生嚴重的病圃中種植耐病品種魯棉研21 號。 根據(jù)試驗設(shè)計種植小區(qū)，每個小區(qū)長3.3 m，寬2.8 m，株距20 cm。 試驗設(shè)置3 次重復(fù)，3 行為1 個處理，即9 行為1 個處理區(qū)組。

培養(yǎng)液浸種：取適量消毒后的種子在EBV02培養(yǎng)液中浸種處理12 h，無菌水多次洗滌種子后播種，以無菌LB 液體培養(yǎng)基浸種為對照，播種后10 d 統(tǒng)計魯棉研21 號種子的出苗數(shù)并計算出苗率；出苗后25 d，每個處理隨機取15 株棉苗，測量主根長、株高、鮮物質(zhì)質(zhì)量等指標。 培養(yǎng)液灌根：待棉花出苗后，在棉花根部加入EBV02 培養(yǎng)液，每小區(qū)用量0.8 L，以等體積無菌LB 液體培養(yǎng)基灌根為對照。 培養(yǎng)液噴霧： 將制備好的EBV02 培養(yǎng)液噴施在棉苗上， 之后每隔20 d 噴霧1 次，共2 次，每小區(qū)用量0.4 L，以等體積無菌LB 液體培養(yǎng)基噴霧為對照。 病情的分級標準、病情指數(shù)和防治效果的計算同1.4.2。

棉花收獲時調(diào)查其株高、單株果枝數(shù)、單株結(jié)鈴數(shù)、30 鈴籽棉質(zhì)量和30 鈴皮棉質(zhì)量。

1.5 EBV02 防治棉花黃萎病作用機理探究

1.5.1EBV02 培養(yǎng)液誘導(dǎo)棉花葉片抗性的檢測。將消毒后的種子浸泡在已活化好的EBV02 培養(yǎng)液中12 h，將種子用無菌水沖洗2～3 次，以每缽8 粒播種在紙缽中， 棉苗長到3 片真葉后，用EBV02 培養(yǎng)液進行灌根處理，2 d 后取棉花真葉進行表面消毒，再用無菌水沖洗2～3 次，置于水瓊脂培養(yǎng)基表面，將葉片表面造成傷口，在葉片傷口處接種Vd080 菌餅。 以單獨接種無菌LB 液體培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)5 次。 25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察葉片損傷情況[11]。

1.5.2EBV02 培養(yǎng)液誘導(dǎo)棉花葉片活性氧爆發(fā)的檢測。 棉苗長出2 片真葉后，用EBV02 培養(yǎng)液灌根，每個紙缽10 mL，以接種等量無菌LB 液體培養(yǎng)基為對照。 接種2 d 后，利用3,3- 二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）組織染色法檢測棉花葉片中活性氧爆發(fā)和積累，取長勢相近的棉花真葉，用無菌水洗滌后置于50 mL 離心管中，取適量DAB 染液（1 g·L-1，pH 7.5）加入離心管中，室溫避光染色8 h；去除染液后，加入適量95%（體積分數(shù)）乙醇在沸水中水浴2 min 脫去葉綠素， 去除液體后加適量無水乙醇繼續(xù)脫色，直至綠色完全脫去。 最后將葉片浸泡到70%（體積分數(shù)）甘油中，趕出葉片細胞間氣泡，將葉片放置到載玻片上采用體式顯微鏡Leica M165FC 進行觀察。

1.5.3棉花葉片胼胝質(zhì)沉積測定。 棉苗長出2 片真葉后， 用EBV02 培養(yǎng)液灌根， 在棉花接菌前（對照）以及接菌后48 h 分別隨機取棉苗5 株。取1 片完整真葉，在乙醇與乙酸體積比為3∶1 的固定液中固定2～3 h，脫去葉綠素。 依次在體積分數(shù)為70%和50%的乙醇中浸泡3 h， 然后于無菌水中浸泡過夜。 次日倒掉水后，輕輕漂洗葉片，將葉片在10%（質(zhì)量分數(shù)）NaOH 中浸泡1～2 h，使葉片變透明。 用蒸餾水清洗葉片4 次， 隨后于0.01%（質(zhì)量分數(shù)）的苯胺藍染色液中避光培養(yǎng)3 h， 最后用熒光體式顯微鏡Nikon 80i 觀察胼胝質(zhì)的積累情況。

1.5.4棉花防御相關(guān)基因表達量的測定。 棉花1片真葉初現(xiàn)后，用EBV02 培養(yǎng)液灌根，處理后3 d，每紙缽接種10 mL 的Vd080 孢子懸浮液（含量為1×107mL-1）， 每6 個紙缽為1 個處理，每個處理重復(fù)3 次，以等體積無菌LB 液體培養(yǎng)基灌根為對照。 接種Vd080 后24 h、48 h 和72 h 取樣。 采用RNAprep Pure Plant Kit（天根公司）提取棉花葉片RNA，用NanoDrop 2000 檢測RNA 的質(zhì)量濃度，并將RNA 的質(zhì)量濃度調(diào)到100 mg·L-1，備用。cDNA 第1 鏈的合成和熒光定量PCR 參照張蕓等[16]的方法，檢測棉花葉片中防御相關(guān)基因過氧化物酶基因（peroxidase gene,POD）、多酚氧化酶基因（polyphenol oxidase gene,PPO）、苯丙氨酸氨裂合酶基因 （phenylalanine ammonia-lyase,PAL）、病程相關(guān)蛋白10 基因（pathogenesis-related protein 10 gene,PR10）和茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因JAR1（jasmonate resistant gene 1）的表達量，以棉花中高度保守的基因ubiquitin為內(nèi)參基因，相關(guān)引物見表1。

表1 防御相關(guān)基因的特異性引物Table 1 Specific primer sequences of defense-related genes

1.5.5數(shù)據(jù)處理。 試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2019 進行處理，采用IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析程序進行差異顯著性分析。 采用鄧肯新復(fù)極差法比較處理之間的差異顯著性（P＜0.05）。 所有數(shù)據(jù)在統(tǒng)計分析時，先進行了正態(tài)性檢驗，均符合正態(tài)分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBV02 的菌種鑒定

EBV02 在LB 培養(yǎng)基上生長良好，經(jīng)形態(tài)學鑒定，菌落顏色為乳白色，表面光滑，不透明，單菌落形態(tài)為球形（圖1A）；經(jīng)革蘭氏染色，菌體呈紫紅色的短桿狀（圖1B），確定為革蘭氏陽性細菌。 根據(jù)測序結(jié)果與GenBank 中相關(guān)菌株16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 其與模式菌株B.velezensis的相似性最高， 為99.72%（圖1C）。伏- 波試驗（Voges-Proskauer test,VP test）和硝酸鹽還原反應(yīng)均呈陽性，可以水解淀粉，不能產(chǎn)生H2S。 結(jié)合其培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)和分子生物學鑒定， 確定該內(nèi)生細菌為貝萊斯芽孢桿菌，記為EBV02。

圖1 EBV02 的菌種鑒定Fig. 1 Species identification of the strain EBV02

2.2 內(nèi)生細菌對大麗輪枝菌的拮抗作用分析

2.2.1EBV02 對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用。對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果（圖2A、B）顯示，培養(yǎng)10 d后，經(jīng)EBV02 處理的Vd080 菌落直徑為19.4 mm，未經(jīng)EBV02 處理的Vd080 菌落直徑為44.2 mm，EBV02 對Vd080 菌絲生長的抑制率為63.27%。表明，EBV02 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 的菌絲生長有較強的抑制作用。

對扣培養(yǎng)試驗結(jié)果（圖2C、D）顯示：對照中Vd080 菌落正常生長的直徑為51.3 mm， 菌落為白色、無微菌核；而接種EBV02 的Vd080 菌落上長出了微菌核， 菌絲生長被抑制， 菌落直徑為23.6 mm，抑制率為59.83%。表明，EBV02 的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 的菌絲生長也有抑制作用。

圖2 培養(yǎng)10 d 后EBV02 對大麗輪枝菌菌絲的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of the strain EBV02 on the hyphae of V. dahliae after 10 d of culture

2.2.2EBV02 對大麗輪枝菌產(chǎn)孢的抑制作用。產(chǎn)孢量試驗結(jié)果（圖3）顯示：在混合培養(yǎng)24 h、48 h和96 h 時，EBV02 對Vd080 的產(chǎn)孢量均有顯著抑制作用， 抑制率分別為32.24%、41.61%和21.86%； 不同培養(yǎng)時間的EBV02 培養(yǎng)液對Vd080 產(chǎn)孢量的抑制作用有差異， 其中混合培養(yǎng)48 h 時的抑制效果最好。 上述結(jié)果表明EBV02 培養(yǎng)液對大麗輪枝菌分生孢子的產(chǎn)生具有抑制作用。

圖3 大麗輪枝菌產(chǎn)孢量的比較Fig. 3 Comparisons of spore production of Verticillium dahliae

2.2.3EBV02 對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的抑制效果。 微菌核與EBV02 培養(yǎng)液暗培養(yǎng)20 h 的萌發(fā)結(jié)果（圖4）顯示：EBV02 培養(yǎng)液原液、1/2 稀釋液和1/4 稀釋液中混合培養(yǎng)的微菌核萌發(fā)率均與對照（41.20%）差異顯著，抑制率分別為64.56%、41.75%和31.55%，表明EBV02 培養(yǎng)液對微菌核萌發(fā)有抑制作用，且抑制作用隨著EBV02 培養(yǎng)液濃度的增大而增強。

圖4 暗培養(yǎng)20 h 微菌核萌發(fā)率比較Fig. 4 Comparisons of sclerotium germination rates at 20 h of dark culture

2.3 EBV02 對棉花黃萎病的防治效果

2.3.1EBV02 浸種處理對種子萌發(fā)的影響。如表2 所示，經(jīng)過不同濃度菌液浸泡的處理組，棉種萌發(fā)率和芽長分別比對照組提高了3.26%和8.50%、3.26%和6.54%、4.88%和16.34%，但差異均不顯著。

表2 浸種處理棉種萌發(fā)率和芽長比較Table 2 Comparisons of germination rates and shoot length between seed soaking treatments

2.3.2EBV02 對棉花黃萎病的溫室防治效果。結(jié)果（表3）顯示：EBV02 浸種處理的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照，對棉花黃萎病的溫室防治效果為68.33%；EBV02 灌根處理的棉苗其發(fā)病率和病情指數(shù)與對照組相比，分別顯著降低了24.97%和57.62%。 表明，EBV02 浸種和灌根處理都可以顯著降低棉苗的發(fā)病率和病情指數(shù)，對棉花黃萎病具有良好的防治效果。 此外，與灌根法相比，浸種法對棉花黃萎病的防治效果更好（圖5）。

圖5 溫室條件下EBV02 處理對棉花黃萎病的防治效果Fig. 5 Control effect of EBV02 treatment on cotton Verticillium wilt in a greenhouse

表3 接種大麗輪枝菌15 d 后EBV02 對棉花黃萎病的溫室防治效果Table 3 Control effect of EBV02 on cotton Verticillium wilt at 15 d after inoculation with V. dahliae in a greenhouse

2.3.3溫室環(huán)境中不同處理下的棉花生長指標分析。 如表4 所示，培養(yǎng)液浸種和灌根處理生長25 d 的棉苗主根長、株高、地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量和總鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于對照， 增幅分別為62.26%和28.57%、77.77%和34.00%、108.00%和65.43%、103.61%和65.91%，表明EBV02 對棉苗的生長發(fā)育有促進作用。

表4 出苗后25 d 不同處理棉花生長指標的比較Table 4 Comparison of cotton growth indexes of different treatments at 25 d after seedling emergence

2.3.4EBV02 對棉花黃萎病的大田防治效果。棉花播種后60 d 的大田棉苗發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果（表5）顯示，培養(yǎng)液浸種、灌根和噴霧處理的棉苗發(fā)病率和病情指數(shù)與對照相比均顯著降低，防治效果為23.82%～37.25%。 其中，培養(yǎng)液噴霧防治棉花黃萎病效果最好，發(fā)病率和病情指數(shù)與對照相比分別降低了41.09%和37.25%。

表5 棉花播種后60 d EBV02 對棉花黃萎病的大田防治效果Table 5 Field control effect of the strain EBV02 on cotton Verticillium wilt at 60 d after sowing

2.3.5浸種處理的大田棉花出苗率及生長指標分析。由表6 可知，與對照相比，EBV02 浸種處理的棉花出苗率顯著提高，增幅為6.40%，棉苗的地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量和總鮮物質(zhì)質(zhì)量分別顯著增加8.41%和7.67%，表明EBV02 浸種處理有利于棉苗的物質(zhì)積累。此外，EBV02 處理的棉苗主根長、株高與對照均無顯著差異。

表6 浸種處理棉花出苗和生長指標的比較Table 6 Comparisons of cotton emergence rates and growth indexes between seed soaking treatments

2.3.6EBV02 對大田棉花產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響。如表7 所示，EBV02 培養(yǎng)液浸種、 灌根和噴霧處理均能顯著增加收獲期棉花的株高、30 鈴籽棉質(zhì)量和30 鈴皮棉質(zhì)量。 其中，浸種、灌根和噴霧處理的30 鈴籽棉質(zhì)量和30 鈴皮棉質(zhì)量與對照相比分別增加12.60 g 和5.00 g、5.53 g 和3.47 g、11.53 g 和4.47 g， 增幅分別為8.34%和8.26%、3.38%和5.60%、7.04%和7.06%。

表7 大田條件下不同EBV02 處理與對照棉花產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀的比較Table 7 Comparisons of cotton yield and yield-related traits between EBV02 treatment and control under field conditions

2.4 EBV02 防治棉花黃萎病的作用機理探究

2.4.1EBV02 培養(yǎng)液誘導(dǎo)棉花抵御大麗輪枝菌。將棉花真葉在水瓊脂培養(yǎng)基表面培養(yǎng)7 d 后，EBV02 培養(yǎng)液灌根處理的葉片表面菌絲附著較少， 而灌根對照的葉片表面有大量菌絲定植，壞死面積較大，且葉片損傷程度更嚴重（圖6）。

圖6 EBV02 誘導(dǎo)棉花葉片抗大麗輪枝菌表現(xiàn)Fig. 6 Performance of EBV02 enhanced cotton leaves against V. dahliae

2.4.2EBV02 培養(yǎng)液誘導(dǎo)棉花葉片活性氧爆發(fā)。鏡檢結(jié)果（圖7）表明，經(jīng)EBV02 培養(yǎng)液灌根處理的棉花葉片中褐色沉淀較多，而在對照中，褐色沉淀較少， 表明EBV02 誘導(dǎo)了棉花葉片中活性氧爆發(fā)。

圖7 EBV02 引起棉花葉片活性氧爆發(fā)表型Fig. 7 Performance of EBV02 triggered the burst of reactive oxygen species in cotton

2.4.3棉花葉片中胼胝質(zhì)沉積對比。 鏡檢結(jié)果（圖8） 表明， 接種EBV02 培養(yǎng)液2 d 后， 經(jīng)EBV02 灌根處理的棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累量較多， 而在對照中胼胝質(zhì)的積累量較少， 表明EBV02 誘導(dǎo)了棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累。

圖8 EBV02 誘導(dǎo)棉花葉片胼胝質(zhì)的積累Fig. 8 EBV02 induced callose accumulation in cotton leaves

2.4.4EBV02 誘導(dǎo)棉花防御相關(guān)基因的表達分析。 基因表達量檢測結(jié)果（圖9）表明，經(jīng)過EBV02 培養(yǎng)液灌根處理后， 葉片中POD、PPO、PAL、PR10和JAR1基因的表達量均升高。PAL和PR10在接種后24 h 的表達量分別是對照組的1.80 倍和1.32 倍， 在接種后72 h 分別是對照組的21.35 倍和108.00 倍。 表明EBV02 灌根處理能激活棉花的防御系統(tǒng)，增強其對棉花黃萎病的抵抗能力。

圖9 防御相關(guān)基因表達量檢測結(jié)果Fig. 9 The expression levels of defense-related genes

3 討論

利用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制植物病原菌的發(fā)生和危害， 是綠色環(huán)保的防治策略。目前，研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對多種植物病原菌具有抑制作用， 例如貝萊斯芽孢桿菌DPT-03對花生白絹病的防治效果達到了62.50%，可以有效抑制病原菌菌絲生長和微菌核的形成，抑制率高達87.20%～88.51%， 顯著降低花生白絹病的發(fā)病率和發(fā)病程度，且提高花生產(chǎn)量[17]。本研究從棉花的內(nèi)生細菌EBV02 入手，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和分子生物學鑒定， 明確EBV02 為貝萊斯芽孢桿菌。 通過對峙培養(yǎng)和對扣培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)EBV02 對大麗輪枝菌Vd080 菌絲生長的

抑制率分別為63.27%和59.83%；EBV02 培養(yǎng)液對Vd080 產(chǎn)孢量和微菌核萌發(fā)的平均抑制率分別為31.90%和45.95%； 對棉花黃萎病菌溫室防治效果高達68.33%，并能激活棉花抗病防御系統(tǒng)。

目前，對內(nèi)生菌生防潛力的測定絕大多數(shù)在實驗室或溫室進行，在田間進行的較少。 室內(nèi)篩選出對病原菌拮抗效果較強的生防菌株，在大田中常出現(xiàn)防治效果不穩(wěn)定的情況[18]。溫室試驗中，采用EBV02 培養(yǎng)液浸種和灌根處理對棉花苗期黃萎病均表現(xiàn)出較好的防治效果（57.62%～68.33%）， 但是大田防治效果僅為23.82%～37.25%，分析其原因可能是內(nèi)生菌是一個生物活體，大田環(huán)境中的一些生物和非生物因素都會影響其防治效果[19]。董玉潔[20]用生防菌鏈霉菌GX-8處理苦瓜幼苗，與對照相比，株高增加60.00%，莖粗增加12.00%，鮮物質(zhì)質(zhì)量增加54.05%，干物質(zhì)質(zhì)量增加20.59%。有研究已證實生防菌可以提高棉花產(chǎn)量、株高、單株結(jié)鈴數(shù)、單株果枝數(shù)等[16]。溫室試驗中經(jīng)EBV02 培養(yǎng)液處理的棉花，其主根長、株高、地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量和總鮮物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于對照組， 對棉苗生長具有較好的促生作用。 大田試驗中EBV02 培養(yǎng)液浸種、灌根和噴霧處理對棉花的籽棉和皮棉增產(chǎn)效果顯著。 這些結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌EBV02 不僅能夠防控棉花黃萎病， 還能夠明顯提高棉花產(chǎn)量。

生防菌的誘導(dǎo)抗性作用須與競爭作用、重寄生作用、拮抗作用以及植物促生作用以及其他作用機制共同協(xié)作才能發(fā)揮增效作用[21]。 活性氧在調(diào)節(jié)植物生長和增強抗逆性方面具有重要作用[22]，胼胝質(zhì)被視為植物抵抗病原菌的物理屏障[23]。 EBV02 培養(yǎng)液灌根處理，可顯著抑制大麗輪枝菌對棉花葉片的侵染，促進棉花葉片活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)積累，減少大麗輪枝菌在葉片中的定植。 苯丙氨酸解氨酶是合成木質(zhì)素、酚類物質(zhì)等抑菌物質(zhì)的關(guān)鍵酶，對植物抗病系統(tǒng)的激活至關(guān)重要[24]。PR10 是植物在受到各種生物和非生物脅迫后產(chǎn)生的一類病程相關(guān)蛋白，在植物的發(fā)育和對外界逆境環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[25]。 本研究發(fā)現(xiàn)，EBV02 培養(yǎng)液灌根處理可誘導(dǎo)PAL、POD、PPO、PR10和JAR1的顯著上調(diào)表達。 綜上，貝萊斯芽孢桿菌EBV02 能夠誘導(dǎo)棉花對大麗輪枝菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，具有較好的防病效果。 但本研究對其防病機理只是初步探討，對其更深層次的作用機理包括其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還有待進一步研究。

4 結(jié)論

篩選并鑒定了內(nèi)生細菌貝萊斯芽孢桿菌EBV02， 其非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能有效抑制棉花黃萎病菌Vd080 的菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生和微菌核的萌發(fā)， 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物也可以抑制Vd080 菌絲的生長；溫室和大田試驗表明，施用EBV02 能降低黃萎病發(fā)病率和病情指數(shù)， 且對棉苗生長發(fā)育及產(chǎn)量具有促進作用。 此外，EBV02 可提高棉花葉片抵抗黃萎病菌侵染的能力，引起葉片活性氧爆發(fā)、 胼胝質(zhì)積累和防御基因的上調(diào)表達，表明EBV02 能誘導(dǎo)棉花對黃萎病的系統(tǒng)抗性。 綜上所述，EBV02 在防治棉花黃萎病方面具有較好的應(yīng)用前景，可為研發(fā)微生物菌劑提供參考。