棉花陸海漸滲系次級分離群體產(chǎn)量和纖維品質(zhì)QTL 定位

楊芮，李鵬濤，肖向輝，李俊文，龔舉武，劉愛英，鞏萬奎，商海紅，葛群，盧全偉，潘境濤，鄧曉英，范森淼，石玉真*，袁有祿*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南 安陽 455000；2. 安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000）

棉花是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，其天然纖維為全球提供關(guān)鍵的紡織原材料[1]。 面對日益減少的耕地和不斷增長的人口數(shù)量，以及現(xiàn)代棉紡織工業(yè)的迅猛發(fā)展和人們對衣著品質(zhì)需求的逐漸提高，同步改良產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀，培育和推廣優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的棉花品種成為越來越迫切的需求。 然而，棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)均屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，由多基因控制且易受環(huán)境因素的影響，兩者表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系[2-4]，導(dǎo)致產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的同步遺傳改良進(jìn)展緩慢。

四大棉花栽培種中， 陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（G.barbadense）是異源四倍體，每年貢獻(xiàn)超過95%的棉花總產(chǎn)量。 陸地棉品種具有高產(chǎn)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點，但纖維品質(zhì)普通；而海島棉品種纖維品質(zhì)優(yōu)異，但產(chǎn)量低、適應(yīng)性差[5]。 因此，借助染色體片段代換系（chromosome segment substitution line,CSSL） 將海島棉優(yōu)異的纖維品質(zhì)基因?qū)腙懙孛?，拓寬陸地棉栽培品種狹窄的遺傳基礎(chǔ)（長期人工選擇所致），為充分聚合陸海優(yōu)異性狀基因提供了新的方法， 也為培育高產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)的棉花新品種奠定了材料基礎(chǔ)[6]。作為近等基因系（near-isogenic line,NIL）[7]，CSSL可降低群體遺傳背景的干擾，適用于對調(diào)控復(fù)雜數(shù)量性狀或多變表型的遺傳位點進(jìn)行精確定位，尤其是遺傳效應(yīng)相對較小的農(nóng)藝性狀，因而被廣泛應(yīng)用于數(shù)量性狀位點（quantitative trait loci,QTL）定位和候選基因鑒定[8]。 目前，利用CSSL群體鑒定到大量與棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、黃萎病抗性等性狀相關(guān)的QTL[9-10]。

2005 年，Stelly 等[11]首次利用雜交、回交和自交等常規(guī)育種技術(shù)構(gòu)建陸海漸滲系群體，獲得17個陸地棉TM-1 遺傳背景下含海島棉3-79 染色體片段的種質(zhì)系。 王鵬等[12]以陸地棉TM-1 和海島棉7124 為親本， 結(jié)合常規(guī)育種手段和現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection,MAS）技術(shù)構(gòu)建了包含330 個株系的陸海漸滲系群體，為后續(xù)開展棉花重要性狀QTL 的精細(xì)定位和候選基因的克隆研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。 基于陸地棉TM-1 和海島棉3-79 構(gòu)建的陸海漸滲系群體，Luan 等[13]利用輪回親本TM-1 分別與CS-B14Sh和CS-B22Sh 構(gòu)建次級分離群體， 在F2和F2:3群體中鑒別到24 個與產(chǎn)量或纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL。 付央等[14]利用陸地棉TM-1 和染色體片段置換系Sub18（陸地棉TM-1×海島棉3-79）構(gòu)建了包含45 個置換系的群體，檢測到與產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的7 個加性效應(yīng)QTL 和5 個上位性效應(yīng)QTL。 李超等[15]利用陸地棉中棉所8 號和海島棉Pima90-53 構(gòu)建包含182 個株系的陸海漸滲系群體， 挖掘到59 個與產(chǎn)量或纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL。Shi 等[16-17]以陸地棉中棉所36 和海島棉海1為親本構(gòu)建了包含408 個株系的陸海漸滲系群體，結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜和多年多環(huán)境的表型數(shù)據(jù)，挖掘到227 個與產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、黃萎病抗性等相關(guān)的QTL。 向丹[18]在以陸地棉TM-1 為背景獲得了3 個海陸漸滲系材料的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步組配作圖群體，檢測到7 個與產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL。 焦夢佳等[19]選取海島棉優(yōu)異纖維漸滲系和陸地棉品種魯棉研37 號創(chuàng)制F2群體， 成功鑒定出20 個與產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL。 孫穎[20]以黃褐棉和陸地棉中棉所35為雙親構(gòu)建BC3F2群體， 分別鑒定到63 個產(chǎn)量相關(guān)QTL、58 個纖維品質(zhì)相關(guān)QTL。郝永水等[21]以毛棉和陸地棉中棉所35 作為漸滲系的親本材料，在3 個群體中共鑒定出177 個與產(chǎn)量和纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL。

本研究利用高產(chǎn)且適應(yīng)性廣的陸地棉品種中棉所36（CCRI 36）和纖維品質(zhì)優(yōu)異、高抗黃萎病的海島棉品系海1（Hai 1）為親本，通過雜交、高代回交和自交構(gòu)建陸海漸滲系群體BC5F3:5，基于多年多環(huán)境表型數(shù)據(jù)，選育出產(chǎn)量和纖維品質(zhì)優(yōu)良、整齊一致的陸海漸滲系MBI9626；以中棉所36 為輪回親本構(gòu)建次級分離群體； 結(jié)合多態(tài)性簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat,SSR）標(biāo)記和多年多點表型數(shù)據(jù)，開展產(chǎn)量、纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL 定位分析； 借助已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生物信息分析軟件， 挖掘穩(wěn)定QTL 區(qū)間內(nèi)的候選基因，為后續(xù)精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)，同時也為同步改良產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和田間種植

2015 年， 利用陸海漸滲系MBI9626 與輪回親本中棉所36 配制雜交組合， 去雄授粉后獲得F1。2016 年，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（簡稱中棉所）農(nóng)場（河南省安陽縣白壁鎮(zhèn)）種植F1產(chǎn)生包含152 個單株的F2群體， 用AYF2表示該群體。 2017 年，在中棉所農(nóng)場和新疆石河子北泉鎮(zhèn)綜合試驗站（記為“XJ”）按株行種植F2:3株行，共設(shè)置2 個重復(fù)， 分別用AYF2:3和XJF2:3表示這2個群體。 2018 年在中棉所農(nóng)場種植F2:4株系，不設(shè)重復(fù)，用AYF2:4表示該群體。

1.2 遺傳標(biāo)記篩選和群體基因型檢測

F2群體的基因組DNA 提取采用改良CTAB法[22]，依據(jù)Nanodrop 檢測的DNA 濃度，將3 個親本和雜交后代全部單株的DNA 原液稀釋成50 mg·L-1工作液。 基于Shi 等[5]利用中棉所36與海島棉海1 構(gòu)建的陸海漸滲系BC1F1群體繪制的長度為5 115.16 厘摩（centimorgan,cM）的高密度遺傳連鎖圖譜，利用親本從2 292 個SSR 標(biāo)記中篩選多態(tài)性標(biāo)記。 然后，用篩選出的標(biāo)記對F2群體進(jìn)行檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）和銀染法快速檢測。

1.3 數(shù)量性狀的測定

F2群體按單株收取所有成熟棉鈴并記錄鈴數(shù)，F(xiàn)2:3和F2:4群體分別以株行為單位收取30 個棉鈴，自然風(fēng)干后室內(nèi)考種，分別稱量籽棉和皮棉質(zhì)量，計算鈴重（boll weight, BW）和衣分（lint percentage,LP）。 F2群體按單株，F(xiàn)2:3按株行分別取皮棉樣品15 g，送農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心使用HFT900 測試儀按HVI 校準(zhǔn)棉花標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)測定纖維品質(zhì)，包括纖維上半部平均長度（upper half mean length, FL）、斷裂比強(qiáng)度（breakingtenacity,FS）、馬克隆值（micronaire,FM）、長度整齊度指數(shù)（uniformity index,FU）和斷裂伸長率（breaking elongation,FE）。 AYF2:4群體僅測定了鈴重。

1.4 統(tǒng)計分析和QTL 定位

用SPSS 20.0 對各群體的性狀表型值進(jìn)行描述性統(tǒng)計及相關(guān)性分析。 用GGT32 分析漸滲系MBI9626 中漸滲片段的數(shù)量、大小及其分布。 基于Shi 等[5]構(gòu)建的遺傳圖譜，用QTL IciMapping軟件進(jìn)行標(biāo)記的連鎖分析，結(jié)合表型數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行單標(biāo)記作圖分析， 設(shè)置條件數(shù)（condition number）為1 000，對數(shù)優(yōu)勢比（logarithm of the odd score,LOD） 大于等于2.5。 使用Map Chart 2.2 軟件繪制QTL 染色體分布圖。QTL 命名方式統(tǒng)一采用：q＋性狀英文縮寫＋染色體編號＋QTL 編號。 此外，對包含2 個及以上QTL 的區(qū)間進(jìn)行分析， 如果距離在10 cM 以內(nèi)則視為1個QTL 簇，QTL 簇命名規(guī)則為：Clu＋染色體編號＋QTL 簇編號。

選擇包含重要QTL 的區(qū)段， 根據(jù)QTL 的側(cè)翼標(biāo)記查找其在陸地棉TM-1 參考基因組[1]對應(yīng)的物理區(qū)間，從CottonFGD 網(wǎng)站（http://cottonfgd.net/）下載區(qū)間內(nèi)所有基因的序列。 基于Hu 等[23]發(fā)表的陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 開花當(dāng)天（0 day post anthesis,0 DPA)、1 DPA、3 DPA、5 DPA 的胚珠和10 DPA、20 DPA 和25 DPA 的纖維RNA-seq 數(shù)據(jù)（http://cotton.zju.edu.cn/），利 用 軟 件edgeR 對區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行差異表達(dá)基因鑒別，按照偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR）小于0.05 和log2(fold change)大于2（fold change 是差異倍數(shù)）的過濾閾值對上述7 個樣本進(jìn)行兩兩比對。 對富集到GO 類別中前25 個生物學(xué)過程的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene, DEG）和富集到KEGG 類別中前25 個信號通路的差異表達(dá)基因取并集后， 篩選在纖維發(fā)育過程中高表達(dá)的基因，用每個基因的表達(dá)量減去這個基因在所有樣本中表達(dá)量的均值，然后除以其標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行歸一化處理，比較基因表達(dá)水平。 利用Blast 軟件比對找到相應(yīng)的海島棉基因ID，將陸地棉和海島棉中同源基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對以確定候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀描述性分析

利用SPSS 20.0 軟件對4 個群體的2 個產(chǎn)量相關(guān)性狀和5 個纖維品質(zhì)相關(guān)性狀的表型值進(jìn)行描述性分析， 并以中棉所36 為對照 （表1）。AYF2分離群體的鈴重、衣分、上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)的平均值均低于中棉所36。 XJF2:3和AYF2:3群體除衣分外的6 個指標(biāo)的表型值，以及F2:4群體的鈴重均高于中棉所36。 各性狀變異系數(shù)在1.05%～7.93%，易受環(huán)境影響，分離群體中存在明顯的差異。 所有性狀偏度的絕對值均小于1，表明4 個群體中均沒有出現(xiàn)異常的偏分離。峰度的絕對值均小于1， 表明采集到的各群體的表型數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布，可以用于QTL 分析。

表1 親本及群體產(chǎn)量和纖維品質(zhì)相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析Table 1 Analysis of phenotypic data of yield- and fiber quality-related traits for parents and four populations

2.2 產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

對同一環(huán)境下不同性狀間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn) （表2），AYF2:3和XJF2:3的鈴重與衣分顯著負(fù)相關(guān)，AYF2的鈴重與上半部平均長度顯著負(fù)相關(guān)， 鈴重與其他纖維品質(zhì)指標(biāo)無顯著相關(guān)關(guān)系。衣分與馬克隆值在2 個環(huán)境中表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（AYF2除外）；上半部平均長度與長度整齊度指數(shù)（AYF2除外）、斷裂比強(qiáng)度、斷裂伸長率極顯著正相關(guān)，與馬克隆值（XJF2:3除外）極顯著負(fù)相關(guān)； 斷裂比強(qiáng)度與馬克隆值極顯著負(fù)相關(guān)、與斷裂伸長率極顯著正相關(guān)；長度整齊度指數(shù)與斷裂伸長率顯著或極顯著正相關(guān)。

2.3 基因型分析

共篩選出109 個SSR 多態(tài)性標(biāo)記，分布于除8 和18 號染色體之外的24 條染色體上。參考Shi等[5]構(gòu)建的遺傳圖譜，漸滲系MBI9626 的遺傳背景94.8%恢復(fù)為輪回親本中棉所36， 遺傳長度4 851.3 cM； 漸滲純合片段長212.7 cM， 占比為4.2%；雜合片段長51.2 cM，占比為1.0%，明顯少于純合片段，便于后續(xù)的遺傳分析。

利用篩選出的標(biāo)記對AYF2群體中152 個單株進(jìn)行檢測， 恢復(fù)到中棉所36 背景的平均值為99.6%；海1 漸滲片段的平均長度為20.46 cM，占比為0.4%。 共有136 個單株包含海1 片段，最多有22 個片段， 平均每株有10.68 個漸滲片段；這些單株中海1 片段的長度集中于10.23～35.81 cM。

2.4 QTL 定位分析

共檢測到28 個與產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL，分布在6 條染色體上（表3，圖1），17 號染色體上最多，共13 個。 共檢測到16 個與產(chǎn)量相關(guān)的QTL， 其中7 個與鈴重相關(guān)，9 個與衣分相關(guān)，表型貢獻(xiàn)率為2.25%～6.14%，包括6 個在多年/多環(huán)境被檢測到的QTL。表型貢獻(xiàn)率大于5%的有qLP-17-2、qLP-17-3和qLP-17-4。 其中3個鈴重QTL、6 個衣分QTL 的加性效應(yīng)值為負(fù)值，加性效應(yīng)均來源于中棉所36。

圖1 在3 個群體中檢測到的與產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的QTLFig. 1 QTL mapping for yield- and fiber quality-related traits in three populations

表3 在3 個群體中檢測到的與產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的QTLTable 3 QTL for yield- and fiber quality-related traits in three populations

同時，檢測到12 個與纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL，包括3 個上半部平均長度QTL、4 個斷裂比強(qiáng)度QTL、4 個馬克隆值QTL、1 個長度整齊度指數(shù)QTL， 表型貢獻(xiàn)率為2.49%～12.30%； 其中qFM-17-2和qFM-17-3在2 個群體中被檢測到。加性效應(yīng)來自海1 的QTL 有4 個， 上半部平均長度QTL 1 個、斷裂比強(qiáng)度QTL 2 個、馬克隆值QTL 1 個。

2.5 QTL 簇的分布

分析QTL 定位結(jié)果（圖1）， 發(fā)現(xiàn)部分QTL具有成簇分布的特點，共有7 個QTL 簇分布在4條染色體上。 QTL 簇Clu-05-1 包括qBW-05-1、qLP-05-1、qFL-05-1、qBW-05-2和qLP-05-2共5個QTL，Clu-10-1 包 括qBW-10-1、qLP-10-1和qFL-10-1，Clu-10-2 包括qLP-10-2和qFM-10-1，Clu-12-1 有qFS-12-1和qFS-12-2，Clu-17-1 包括qBW-17-1和qFM-17-1，Clu-17-2 包括qBW-17-2、qLP-17-2和qFM-17-2共3 個QTL，Clu-17-3 包括qBW-17-3、qFU-17-1、qLP-17-3、qLP-17-4、qFL-17-1和qFS-17-1共6 個QTL。

2.6 候選基因的預(yù)測

鑒于Clu-17-3 中QTL 數(shù)目最多， 本研究對該QTL 簇進(jìn)行深入分析。 該區(qū)間位于標(biāo)記CGR6185 和HAU1413 之間，對應(yīng)陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 參考基因組的44.1～47.8 Mb 區(qū)間內(nèi)，物理長度為3.7 Mb，包含233 個基因。

隨后， 基于已發(fā)表的陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 0、1、3、5、10、20 和25 DPA 的胚珠和纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共篩選到118 個差異表達(dá)基因，并對這些基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 分析。 GO 聚類結(jié)果顯示， 差異表達(dá)基因顯著富集到木質(zhì)部發(fā)育（GO:0010089）、氣孔運動的調(diào)節(jié)（GO:0010119）、氣孔運動（GO:0010118）等生物學(xué)過程（附表1），而在KEGG 聚類結(jié)果中顯著富集到的信號通路主要包括內(nèi)酰胺生物合成（ko00261）、磷酸肌醇代謝（ko00562）、賴氨酸生物合成（ko00300）等（附表2）。 隨后，對富集到GO 類別中前25 個生物學(xué)過程的9 個差異表達(dá)基因和富集到KEGG 類別中前25 個信號通路的10 個差異表達(dá)基因取并集，篩選出17 個候選基因。

對17 個候選基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GH_D03G1443、GH_D03G1511、GH_D03G1526、GH_D03G1544和GH_D03G1611這5 個候選基因的表達(dá)量較低，F(xiàn)PKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）均低于10，因此對其余的12 個候選基因進(jìn)行序列分析。序列比對發(fā)現(xiàn)GH_D03G1458、GH_D03G1460、GH_D03G1511、GH_D03G1517、GH_D03G1552和GH_D03G1593這6 個基因與其在海島棉中的同源基因編碼的氨基酸序列完全一致，另外6 個候選基因GH_D03G1428、GH_D03G1466、GH_D03G1518、GH_D03G1570、GH_D03G1586和GH_D03G1640與其在海島棉中的同源基因的編碼蛋白存在序列差異，推測這6 個基因可能與纖維發(fā)育相關(guān)。

對這6 個基因的表達(dá)模式（圖2）和注釋信息分析， 同時參考擬南芥中同源基因信息，編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶 （triosephosphate isomerase）的GH_D03G1428在0～3 DPA 胚珠中的表達(dá)量持續(xù)升高且在3 DPA 達(dá)到最大值，然后在5 DPA胚珠和10～25 DPA 纖維中的表達(dá)量逐漸降低，暗示該候選基因可能在纖維起始階段發(fā)揮重要的作用。 編碼RNA 結(jié) 合 蛋 白（RNA-binding protein）的GH_D03G1466在0～5 DPA 胚珠和10～25 DPA 纖維中的表達(dá)量呈波浪式上調(diào)、下調(diào)，且在1 DPA 和20 DPA 分別達(dá)到最高值和第二高值，暗示該候選基因可能在纖維發(fā)育起始階段和次生壁加厚期發(fā)揮重要的作用。編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-like family protein）的GH_D03G1518在0～5 DPA 胚珠和10～25 DPA 纖維中的表達(dá)量不斷升高且在20 DPA 纖維中達(dá)到最大值，在25 DPA 纖維中表達(dá)量降低， 暗示該候選基因可能在纖維發(fā)育起始和伸長階段發(fā)揮重要的作用。 編碼重金屬轉(zhuǎn)運/ 解毒超家族蛋白（heavy metal transport/detoxification superfamily protein）的GH_D03G1570的表達(dá)量由0 DPA 纖維中的最高值逐漸降低，隨后先上升、再下降、又上升，暗示該候選基因在纖維發(fā)育起始階段發(fā)揮重要的作用。 編碼CHY 型/ 環(huán)型鋅指蛋白（CHY-type/RING-type zinc finger protein）的GH_D03G1586在0～3 DPA 胚珠中的表達(dá)量逐漸升高，在5 DPA 胚珠中的表達(dá)量降低，此后在10～25 DPA 纖維中的表達(dá)量逐漸由最高降至最低，暗示該候選基因可能在纖維發(fā)育起始階段和伸長與次生壁加厚期發(fā)揮重要的作用。 編碼鹽超敏感互作蛋白（salt overly sensitive interacting protein,SOS3） 的GH_D03G1640在0～5 DPA 的胚珠及10～25 DPA 的纖維中的表達(dá)量呈波浪式上調(diào)和下調(diào)交替變化，且在1 DPA 胚珠中的表達(dá)量最高，暗示該候選基因可能在纖維發(fā)育起始階段發(fā)揮重要的作用。

圖2 6 個候選基因在陸地棉TM-1 胚珠和纖維中的表達(dá)熱圖Fig. 2 Expression heatmap of six candidate genes in ovule and fiber of upland cotton TM-1

3 討論

3.1 染色體片段代換系群體適于QTL 定位

陸地棉和海島棉共同起源、獨立進(jìn)化，有明顯的基因組分化，二者在植株形態(tài)、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)等表型方面差異明顯[23]。 本研究中利用陸地棉和海島棉雜交構(gòu)建的BC6F2、BC6F2:3和BC6F2:4群體，其產(chǎn)量及纖維品質(zhì)性狀存在廣泛變異，表型值符合正態(tài)分布。CSSL 群體屬于永久分離群體，變異位點以純合基因型為主， 遺傳組成相對穩(wěn)定，遺傳力高[24]。 本研究構(gòu)建的CSSL 群體中，單株的遺傳背景恢復(fù)率平均值為99.6%。 這類遺傳背景清晰的群體適用于QTL 定位分析[25]，即連鎖分析的QTL 結(jié)果不容易受群體結(jié)構(gòu)的影響，直接測定后續(xù)世代的基因型和表型，通過兩者的相關(guān)性可以確定控制產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的基因在染色體上的位置及其遺傳學(xué)效應(yīng)。已經(jīng)在番茄[26]、水稻[27]、小麥[28]、玉米[29]等作物中證實CSSL能提高QTL 分析的準(zhǔn)確性。

3.2 穩(wěn)定QTL 的鑒定

分子育種是當(dāng)前作物遺傳育種的重要研究方向， 產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的QTL 定位有助于解決棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)同步遺傳改良難度大的問題[30]。 因此，多環(huán)境穩(wěn)定的QTL 鑒定是后續(xù)精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)。 通過陸地棉種內(nèi)雜交和陸海群體構(gòu)建獲得的QTL 定位結(jié)果可以通過比較基因組學(xué)分析很好地整合在一起[31]。 不少來源于野生棉、海島棉等的主效QTL 已被檢測出來，但在不同的群體中重復(fù)被鑒定的QTL 數(shù)量并不多。 本研究利用陸海優(yōu)質(zhì)漸滲系MBI9626 為父本、陸地棉品種中棉所36 為母本構(gòu)建次級分離群體F2、F2:3和F2:4進(jìn)行產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的QTL 定位。 穩(wěn)定的QTL 能夠在多年/ 多環(huán)境中同時被檢測出來，本研究定位到的28 個QTL 中，有5 個QTL 可以在2 個環(huán)境中同時被檢測到， 分別是qBW-05-1、qBW-05-2、qLP-17-1、qFM-17-2和qFM-17-3， 有3 個QTL可以在3 個環(huán)境中同時被檢測到， 分別是qLP-17-2、qLP-17-3和qLP-17-4。

與前人利用陸海漸滲系進(jìn)行QTL 定位的研究比較，發(fā)現(xiàn)qBW-05-2與梁燕[32]在BC5F2群體中檢測到的qBW-1-22均位于5 號染色體與標(biāo)記HAU0746 緊密連鎖，增效基因均來自海島棉，與李駿智[33]在BC2F1群體中檢測到的qBW-33-1一樣。qBW-17-1和何蕊[34]在BC5F3:5群體中檢測到的qBN-17-6均與NAU2909 緊密連鎖，增效基因都來源于陸地棉。qBW-17-3與Shi 等[17]在BC1S1群體檢測到的qBW-C17-2均位于17 號染色體且與標(biāo)記CGR6185 緊密連鎖，增效基因均來自于 海 島 棉。qLP-03-1與 何 蕊[34]在BC5F3:4群 體中檢測到的qLP-3-1均位于3 號染色體且與NAU0856 緊密連鎖，加性效應(yīng)值均為正值，增效基因來源于海島棉。qLP-05-2與宋威武[35]在F2群體中檢測到的qLP-5-1均位于5 號染色體與TMB1296 緊密連鎖，增效基因來源于陸地棉。qLP-17-3與Shi 等[5]在BC1S1群體中檢測到的qLP-C17-5均位于17 號染色體與相同標(biāo)記CGR6185 緊密連鎖， 增效基因均來自于陸地棉。qLP-17-4與梁燕[32]在BC5F2群體中檢測到的qLP-14-4均位于17 號染色體， 且與標(biāo)記HAU0195a 緊密連鎖，增效基因來源于陸地棉。qFS-17-1與李邵琦[36]在F2群體中檢測到的qFS-17-2均位于17號染色體與標(biāo)記HAU1413 緊密連鎖， 加性效應(yīng)方向一致， 增效基因來自海島棉。qFM-17-1與Shi 等[24]在BC1S1群體中檢測到的qFM-C17-2均位于17 號染色體與標(biāo)記NAU2909 緊密連鎖，增效基因均來自于陸地棉，同時也與Zhai 等[37]在F2群體中檢測到的qFM-17-7結(jié)果一致。 這9 個QTL 位點與可能與上述已經(jīng)報道的QTL 為同一QTL。本研究中鑒定的另外19 個QTL 未見報道，是新檢測到的QTL。 綜合前人研究結(jié)果，本研究中獲得14 個多環(huán)境穩(wěn)定的QTL， 為候選基因的克隆驗證及產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的遺傳改良奠定了重要基礎(chǔ)。

3.3 增效基因的來源

本研究利用陸海漸滲系定位了7 個控制鈴重的QTL 和9 個控制衣分的QTL， 其中4 個鈴重QTL 和3 個衣分QTL 加性效應(yīng)值為正值，其增效基因來自海島棉，表明控制鈴重和衣分的增效基因并非總來自高值親本中棉所36，也可以來自低值親本海1。 纖維品質(zhì)相關(guān)QTL 中qFL-10-1、qFS-05-1、qFS-17-1和qFM-10-1的增效基因來自海1，另外8 個纖維品質(zhì)相關(guān)QTL 的增效基因來自中棉所36，即控制纖維品質(zhì)的增效基因有的來自高值親本海1， 有的來自低值親本中棉所36，與前人研究結(jié)論[38-41]一致。 因此，優(yōu)異性狀基因的挖掘不能忽視低值親本。

3.4 QTL 簇和候選基因的比較

本研究共發(fā)現(xiàn)7 個QTL 簇。 相關(guān)性分析中，鈴重與衣分負(fù)相關(guān)， 它們相關(guān)的4 對QTL（qBW-05-1 與qLP-05-1、qBW-05-2與qLP-05-2、qBW-10-1與qLP-10-1、qBW-17-2與qLP-17-2以及qBW-17-3與qLP-17-3加性效應(yīng)來自不同親本，育種工作中應(yīng)注重這類QTL 的應(yīng)用。 衣分與馬克隆值正相關(guān)， 它們相關(guān)的2 對QTL（qLP-10-2與qFM-10-1、qLP-17-2與qFM-17-2）加性效應(yīng)方向相同，海島棉的漸滲片段能夠同時增加纖維的衣分和馬克隆值。QTL 簇的加性效應(yīng)方向與性狀的相關(guān)性一致，該結(jié)果與Zhang 等[42]的研究結(jié)果一致，為產(chǎn)量和品質(zhì)的同步改良提供了參考。

本研究中QTL 簇Clu-17-3 包括6 個QTL，該區(qū)間內(nèi)存在233 個基因，預(yù)測其中的6 個候選基因可能與纖維發(fā)育相關(guān)。GH_D03G1428編碼棉花磷酸丙糖異構(gòu)酶， 在擬南芥幼苗萌發(fā)過程中，磷酸丙糖異構(gòu)酶能動員種子中存儲的營養(yǎng)物質(zhì)為幼苗提供能量和碳源，直到自養(yǎng)生長成為可能[43]。GH_D03G1466在擬南芥中的同源基因編碼裂解酶（alginate lyase,ALY），具有將mRNA 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯的功能。 擬南芥aly1突變體在全基因組水平的甲基化、 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄抑制和啟動轉(zhuǎn)基因沉默方面存在缺陷，研究發(fā)現(xiàn)ALY1 可與細(xì)胞骨架和運動蛋白功能相關(guān)[44]；此外，ALY1 蛋白與RNA 解旋酶相互作用，發(fā)揮高效的mRNA 核質(zhì)轉(zhuǎn)運功能確保擬南芥正常生長發(fā)育[45]。 棉花GH_D03G1518與擬南芥中質(zhì)體甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（plastid glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPCp）基因具有較高同源性，該酶在擬南芥花藥中的表達(dá)和催化活性都是花粉發(fā)育所必需的，GAPCp 的缺乏導(dǎo)致雄性不育[46]；另一研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中GAPCp 的下調(diào)會導(dǎo)致植物體內(nèi)糖和氨基酸平衡發(fā)生劇烈變化，導(dǎo)致根系發(fā)育停滯和不育，突變體根系發(fā)育受阻歸因于絲氨酸的缺乏， 根中GAPCp 的主要功能是為絲氨酸的生物合成提供前體[47]。GH_D03G1570在擬南芥中的同源基因中編碼重金屬相關(guān)異戊二烯基植物蛋白（heavy metal-associated isoprenylated plant protein,HIPP），通過調(diào)節(jié)擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細(xì)胞分裂素降解蛋白的含量調(diào)控細(xì)胞分裂素信號活性，從而控制細(xì)胞增殖和分生組織分化的發(fā)育過程，細(xì)胞分裂素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和信號應(yīng)答也對HIPP基因具有反饋調(diào)控機(jī)制[48]。 另外，有研究表明，上游調(diào)控因子HIPP3過表達(dá)會抑制擬南芥中水楊酸鹽的反應(yīng)和水楊酸靶基因的表達(dá)， 并刺激茉莉酮酸酯通路靶基因的表達(dá)，促進(jìn)種子的發(fā)育[49]。GH_D03G1586在擬南芥中的同源基因編碼環(huán)型鋅指蛋白1（CHY zinc-finger and RING ptotein1 , CHYR1），屬于泛素連接酶，響應(yīng)脫落酸和干旱脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)， 在擬南芥發(fā)育和干旱響應(yīng)中起積極作用，其環(huán)型結(jié)構(gòu)域被磷酸化后，泛素連接酶的活性會隨之增強(qiáng)[50]。GH_D03G1640與擬南芥SOS3基因同源， 后者是維持胞內(nèi)Na＋和K＋穩(wěn)態(tài)和擬南芥對高Na＋、低K＋環(huán)境的耐受性所必需的，在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)酶的活性和維持膜電位、滲透調(diào)節(jié)方面至關(guān)重要[51]；另有研究發(fā)現(xiàn)，在輕度鹽脅迫下，SOS3基因通過增加擬南芥的芽源生長素和由上往下的生長素運輸活性參與維持局部生長素最大值，而生長素在根中柱鞘細(xì)胞中的局部積累會觸發(fā)側(cè)根器官發(fā)出指示信號，確定起始細(xì)胞身份[52]。這些基因在纖維發(fā)育過程中的功能有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究共檢測到28 個與產(chǎn)量、 纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL，分布在6 條染色體上，集中在5號和17 號染色體上。 與產(chǎn)量相關(guān)的QTL 有16個，解釋2.25%～6.14%的表型變異，與纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL 有12 個， 解釋2.49%～12.30%的表型變異。 本研究檢測到9 個與前人結(jié)果一致的QTL，其中有3 個多環(huán)境穩(wěn)定的QTL；另外19 個QTL 中包含5 個多環(huán)境穩(wěn)定的QTL， 可為棉花分子標(biāo)記輔助選擇育種工作提供借鑒及依據(jù)，也為后續(xù)進(jìn)一步開展QTL 精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。在17 號（D3）染色體的1 個QTL 簇中預(yù)測了6個可能與纖維發(fā)育相關(guān)的基因GH_D03G1428、GH_D03G1466、GH_D03G1518、GH_D03G1570、GH_D03G1586和GH_D03G1640， 為候選基因的鑒定提供了基礎(chǔ)。