加壓毛細(xì)管電色譜分離氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分*

張瀟晗，張曉蕾，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2 河北省中藥配方顆粒創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091；3 河北省中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，河北 石家莊 050091)

氫溴酸樟柳堿作為M膽堿受體阻斷劑, 具有較強(qiáng)的中樞和外周抗膽堿活性, 能夠解除血管痙攣[1], 改善微循環(huán), 還有平喘、解痙、散瞳、抑制唾液分泌、對(duì)抗有機(jī)磷中毒、抑制血小板活性等作用, 其安全性高于其他同類藥物，將樟柳堿的氫溴酸鹽作為臨床用藥, 研究開(kāi)發(fā)得到的包括注射液、片劑等劑型也已成功應(yīng)用于臨床[2]。氫溴酸樟柳堿是天然提取的托品烷類生物堿，存在莨菪堿、山莨菪堿和阿托品等結(jié)構(gòu)類似的活性物質(zhì)，在藥物分析中需要進(jìn)行分離和鑒別。常用的分析方法有薄層色譜、電泳、液相色譜等方法，本實(shí)驗(yàn)采用新型高效環(huán)保的加壓毛細(xì)管電色譜法[3-4]，對(duì)氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分進(jìn)行分離。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器試劑

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜，上海通微分析技術(shù)有限公司；UV-2102PC 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；超聲波清洗器；旋渦混合器；濾頭，注射器；純水機(jī)。

氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度)；甲醇(分析純);乙腈(色譜純)；實(shí)驗(yàn)用水為RO級(jí)別用水;所有試劑和溶液在進(jìn)樣器前都需要用0.2 μm濾膜過(guò)濾，流動(dòng)相需超聲除氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，置離心管中，加適量甲醇溶解，配置成2 mg/mL的氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，超聲10 min，備用。精密吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各200 μL于3個(gè)離心管中，加甲醇1800 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各100 μL于1個(gè)離心管中，加甲醇2700 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為混標(biāo)。

pCEC-UV色譜條件，毛細(xì)管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑 100 μm，總長(zhǎng)度 45 μm，有效長(zhǎng)度20 cm，ODS填料內(nèi)徑3 μm)；流動(dòng)相：乙腈-50 mmol/L磷酸二氫鉀(含0.08%三乙胺)=15:85；流動(dòng)相的流速為0.07 mL/min,分離電壓為0 KV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。進(jìn)樣量 2 μL；電壓施加在毛細(xì)管的出口端，進(jìn)口端接地。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有機(jī)相乙腈的比例的改變，會(huì)改變樣品在固定相和流動(dòng)相之間的分配比例，從而改變分離度[5]。 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈的體積分?jǐn)?shù)為10%，15%，20%時(shí)的分離效果。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)不出峰，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加到20%，氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿不能完全達(dá)到基線分離。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)選擇15%時(shí)，出峰良好，基本達(dá)到基線分離，因此本實(shí)驗(yàn)選擇15%乙腈為有機(jī)流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了三乙胺對(duì)氫溴酸樟柳堿的分離影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三乙胺的加入可明顯改善峰形，提高靈敏度，因此實(shí)驗(yàn)選擇加入0.08%的三乙胺。

2.2 流動(dòng)相流速的選擇

流速的大小直接改變柱壓，從而影響出峰時(shí)間以及分離度，本實(shí)驗(yàn)考察了(0.05，0.07 mL/min)兩種流速對(duì)氫溴酸樟柳堿三種生物堿的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明在壓力允許的范圍內(nèi)，流速的增大，可減小分離時(shí)間，縮短單個(gè)組分的出峰時(shí)間。因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.07 mL/min。圖1，圖2分別為流速0.05，0.07 mL/min，進(jìn)樣量2 μL混標(biāo)的分離情況，峰1，2，3，分別為氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿。

圖1 混標(biāo)電色譜圖(流速0.05 mL/min，進(jìn)樣量2 μL)

圖2 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL)

2.3 分離電壓的選擇

電壓的增加會(huì)改變電滲流的大小，從而影響各組分之間的保留情況。本實(shí)驗(yàn)考察了不同電壓(+6，+15，0，-6，-15 kV)下對(duì)氫溴酸樟柳堿等三種生物堿的分離效果。由圖3～圖6可知，在毛細(xì)管出口端施加正電壓或負(fù)電壓，都對(duì)氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿的出峰時(shí)間無(wú)顯著影響，也無(wú)改善峰形等影響效果。并且隨著電壓的增大，電流持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)焦耳熱，從而增加基線的平衡時(shí)間。對(duì)比不加電壓的情況，綜合選擇0 kV為分離電壓。

圖3 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，+6 kV)

圖4 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，+15 kV)

圖5 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，-6 kV)

圖6 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，-15 kV)

3 結(jié) 論

本文建立了加壓毛細(xì)管電色譜分離氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分，在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿快速高效分離，該方法的分離時(shí)間短，消耗有機(jī)試劑量小，為氫溴酸樟柳堿等生物堿類成分的分離提供了一種新型快速高效的分離方法。