餐具中殘留十二烷基苯磺酸免疫層析檢測卡研究*

唐桂紅，郭杰標 ，陳華龍，江偉伶，姜麗君，吳帆敏

(1 韶關(guān)市食品藥品檢驗所，廣東 韶關(guān) 512026；2 韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecylbenzene sulfonate, SDBS)具有使用方便、成本低等優(yōu)點，是我國餐具洗滌劑的常用表面活性劑。餐具消毒企業(yè)由于清洗任務(wù)繁重，存在超量使用SDBS洗滌劑且清洗不到位，導(dǎo)致SDBS殘留影響食品安全[1]。世界上許多國家都證實烷基苯磺酸鈉對健康具有負面影響，人體長期攝入過量SDBS能產(chǎn)生誘變性效應(yīng)并引起染色體畸變[2]，影響雄性動物生殖能力[3-4]；增高人類乳腺癌的發(fā)病率[5]；能溶解人體消化道黏膜的脂肪從而影響人體消化與吸收功能，并且對人體皮膚、肝臟有損害作用[6-8]?；赟DBS對人體的毒副作用，《國家飲用水標準檢驗方法》(GB/T5750-2006)明確規(guī)定飲用水不得檢出SDBS殘留，《食品安全國家標準消毒餐(飲)具》(GB14934-2016)規(guī)定餐具中SDBS的殘留量不得超過0.1 mg/100 cm2。

對餐具或飲用水中SDBS殘留量的檢測方法，主要有化學(xué)顯色法[9-10]、光譜檢測法[11-14]、紙層析檢測法[15]，高效液相色譜-熒光檢測器法(High performance liquid chromatograph- fluorescence detector，HPLC- FLD)[16-19]。其中，基于化學(xué)顯色和光譜檢測的方法，檢測靈敏度和專屬性都有提高的需要，容易發(fā)生誤檢和漏檢。而依賴昂貴設(shè)備的色譜檢測操作復(fù)雜、費用高昂，難以現(xiàn)場操作。熒光微球免疫層析法具有靈敏、特異、快速、價廉等優(yōu)點[20]，已在真菌毒素殘留[21,23]、農(nóng)藥殘留[24-27]、獸藥殘留[28]、違法添加物[29-30]等領(lǐng)域的快速篩查廣泛應(yīng)用。本研究如圖1的原理，開發(fā)熒光微球免疫層析快速檢測法(Fluorescent Immuno-chromatographic Assay, FICA)，靈敏、特異、簡便、快速測定餐具中殘留的SDBS，為食品監(jiān)管部門提供可靠的餐具表面活性劑殘留快速檢測工具。

圖1 烷基苯磺酸類表面活性劑熒光免疫層析檢測方法研究原理圖

1 實 驗

1.1 材料與試劑

家兔(新西蘭大白兔)由廣州華東信華實驗動物中心(許可證號44007600002936)提供。家兔飼養(yǎng)于麗珠集團韶關(guān)利民制藥廠清潔級動物中心。

十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecylbenzene sulfonate，SDBS)對照品(純度99%)，默克公司；牛血白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)、完全(不完全) 福氏佐劑、碳二亞胺(ethylcarbodiimide, EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)、四甲聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)、Triton X-100(分析純)、過氧化脲，上海生工生物技術(shù)有限公司；對氨基苯磺酸、對磺基苯甲酸、對甲基苯磺酸(分析純)，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；羊抗兔IgG二抗/酶結(jié)合物，美國Jackson公司；紅色熒光微球(150 nm)，上海坤道生物有限公司；羊抗兔IgG抗抗體，Sigma-Aldrich公司；硝酸纖維素(Nitrocellulose, NC)膜、玻璃纖維膜、聚氯乙烯 (poly vinyl chloride, PVC)襯板、吸水墊，上海捷寧公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶聯(lián)免疫反應(yīng)板,廣州潔特公司；酶聯(lián)免疫讀數(shù)儀,芬蘭Labsystems公司； XYZ 3020型劃膜噴金一體機,上海捷寧公司；CM 3030切條機,上海捷寧公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 合成突出苯磺酸基團的免疫抗原

根據(jù)改良活潑酯法，取2.0 mg對磺基苯甲酸溶于1.0 mL甲醇，加入2.5 mg NHS和3.5 mg EDC，震蕩反應(yīng)1 h，生成對磺基苯甲酸活潑酯，10000 r/min離心20 min，取上清液逐滴加入含20 mg BSA的5 mL NaHCO3溶液(0.15 mol/L)，室溫震蕩反應(yīng)2 h，合成突出苯磺酸基團的免疫抗原。抗原用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)充分透析，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 合成突出苯磺酸基團的檢測抗原

根據(jù)重氮法，取2.0 mg對氨基苯磺酸溶于1.0 mL甲醇，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到1.0，冰浴加入2.5 mg NaNO2震蕩反應(yīng)1 h，生成重氮化對氨基苯磺酸，緩慢滴入20 mL含40 mg OVA的0.15 mol/L 碳酸緩沖液(pH 8.5)，震蕩反應(yīng)2 h，形成重氮化合物合成突出苯磺酸基團的檢測抗原?？乖肞BS充分透析，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動物免疫

以突出苯磺酸基團的免疫抗原免疫家兔。首免取50 μg免疫抗原加等量完全弗氏佐劑乳化，皮下多點免疫家兔。首次免疫4周后，用不完全弗氏佐劑乳化等量免疫抗原，對家兔加強免疫；后每3周加強免疫，共加強3次。最后加強免疫6天后心臟取血，分離血清分裝凍存。

1.3.4 抗體的純化及免疫特異性評價

參照前期工作使用的方法[30]，以辛酸/硫酸銨法純化抗體，并通過競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法，測試十二烷基苯磺酸鈉、對甲基苯磺酸鈉、對氨基苯磺酸鈉、對磺基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、苯胺的50%抑制濃度(IC50值)，按公式①分別計算各化合物對SDBS交叉反應(yīng)率(CR)，評價抗體對苯磺酸基團的特異性。

交叉反應(yīng)率(CR)=IC50(SDBS)/IC50(待測化合物)× 100%

(1)

1.3.5 熒光免疫微球的標記

按前期相關(guān)工作的方法[27]，采用EDC活化法標記羧基化納米熒光微球。取1.0 mL熒光微球稀釋在20 mL超純水中，加入新配EDC溶液至終濃度1.0 mmol/L，輕微震蕩10 min活化羧基。將預(yù)活化微球平均分成3份，分別加入苯磺酸抗體至終濃度0.20、0.30、0.40 mg/mL，輕微震蕩30 min使活化的羧基與抗體連接。各種梯度標記的微球在4 ℃以16000 r/min離心30 min，微球用0.01 mol/L PBS(含10% Triton X-100)溶液重懸微球，保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 免疫熒光微球?qū)游?FICA)試紙的組裝。

按前期工作的方法[27]，分別將各梯度標記的微球溶液噴在釋放墊上，30 ℃真空干燥備用。用0.01 mol/L的PBS溶液，分別稀釋檢測抗原到濃度為0.15、0.30、0.45、0.60 mg/mL，羊抗兔IgG二抗溶液稀釋到濃度為0.30 mg/mL。三種檢測抗原溶液和二抗溶液組合，用噴金儀分別在NC膜平行噴涂獲得三種NC膜， 37 ℃干燥備用。如圖2(左)，在PVC襯墊上依序粘貼樣品墊、微球釋放墊、NC膜、吸水墊，用切條機切成5 mm×60 mm的試紙條。

圖2 熒光微球試劑條裝配圖(a);免疫熒光試紙條檢測結(jié)果的判定圖(b)

1.3.7 FICA檢測和判讀。

在樣品墊加3～4滴樣品溶液，樣品液向吸收墊運動，帶動在釋放墊上的免疫熒光微球遷移。固定在T線的檢測抗原與標記微球的免疫結(jié)合，會被SDBS競爭抑制。當(dāng)樣品溶液不SDBS，T線顯示熒光。當(dāng)樣品溶液SDBS超過檢測閾值， T線熒光被抑制消失。

FICA結(jié)果判讀：如圖2(右)，C、T線都顯熒光，樣品不含烷基苯磺酸鈉；C線顯熒光而T線不顯熒光，顯示樣品中烷基苯磺酸鈉超標；C線不顯熒光則試劑失效。

1.3.8 FICA試紙檢測靈敏度優(yōu)化。

以不同抗體濃度標記的免疫微球和抗原噴涂濃度，優(yōu)化FICA對SDBS的檢測靈敏度。用0.01 mol/L PBS配制800、400、200、100、50、25 ng/mL的SDBS溶液，按1.3.7步驟濃度從高到低進行檢測，使T線熒光消失的最低濃度，就是FICA的最低檢測限。

1.3.9 FICA試劑檢測餐具SDBS殘留結(jié)果驗證。

在100 cm2的餐具中滴加0.05、0.10、0.15、0.20 mg的SDBS以110 ℃烤干，用1000 mL的0.01 mol/L PBS充分擦拭餐具提取SDBS，按照1.3.7步驟檢測。每個添加濃度驗證5個樣本，分別統(tǒng)計結(jié)果對檢測性能進行評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體特異性評價

如表1所示，抗體對十二烷基苯磺酸鈉的親和力良好。同時，對4-甲基苯磺酸、4-氨基苯磺酸、4-磺基苯甲酸、苯磺酸等含苯磺酸基團的化合物，在基于4-磺基苯甲酸抗體和對氨基苯磺酸抗原的ELISA檢測中，對結(jié)果的競爭抑制效應(yīng)明顯。證明本研究獲得的抗體，識別苯磺酸基團的特異性良好，能夠用于苯磺酸類表面活性劑的檢測。

表1 抗體對8種相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)率

2.2 檢測線和質(zhì)控線包被濃度優(yōu)化

如圖3顯示，當(dāng)免疫微球抗體包被濃度達到0.30 mg/mL、T線抗原噴涂濃度達到0.45 mg/mL，檢測線的免疫熒光信號趨于穩(wěn)定?？稍诖嘶A(chǔ)上對FICA試紙條檢出限進行優(yōu)化。

圖3 抗體標記濃度(a)和檢測抗原噴涂濃度(b)對熒光免疫層析檢測結(jié)果的影響

2.3 FICA試紙條檢測優(yōu)化

為了使試劑的檢測性能更穩(wěn)定，優(yōu)化的FIAC試紙條選用了0.40 mg/mL抗原噴涂T線，選用0.60 mg/mL抗體標記的熒光微球作為檢測信號。FIAC試紙條檢測SDBS靈敏度驗證結(jié)果如圖4所示，檢測結(jié)果顯示不含烷基苯磺酸鈉的結(jié)果，C線和T線都顯熒光。含50 ng/mL烷基苯磺酸鈉的樣品，檢測線已被很大程度抑制，呈弱陽性。烷基苯磺酸鈉濃度等于或大于100 ng/mL，檢測線全部被抑制，呈強陽性。因此，本FICA試劑對烷基苯磺酸鈉完全競爭抑制的檢測限是100 ng/mL，完全滿足國標檢測餐具中烷基苯磺酸鈉殘留限量檢測的要求。

圖4 熒光免疫層析試劑(FICA)對SDBS標準溶液的最低檢測限驗證結(jié)果

2.4 FICA試劑檢測餐具SDBS殘留結(jié)果驗證

根據(jù)國家標準(GB14934-2016)明確規(guī)定餐具中SDBS的殘留量不得超過0.1 mg/100 cm2[6]的要求，在20個餐具100 cm2的表面添加不同殘留量的SDBS，使用本研究開發(fā)的FICA試劑進行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。

圖5 熒光免疫層析試劑檢測20個表面添加不同SDBS殘留量的現(xiàn)象

結(jié)果統(tǒng)計如表2所示，SDBS殘留量為0.05 mg/100 cm2的餐具，5個樣品均未檢出陽性結(jié)果；SDBS殘留量為0.10 mg/100 cm2以上的餐具，所有樣品全部檢出陽性結(jié)果。

表2 使用FICA試劑檢測不停SDBS殘留量的餐具的結(jié)果統(tǒng)計

實驗結(jié)果證明基于FIAC檢出限和樣品稀釋倍數(shù)，實際樣品檢出靈敏度的設(shè)定，符合GB14934-2016規(guī)定餐具中SDBS的殘留量要求。

3 結(jié) 論

十二烷基苯磺酸(SDBS)是相對分子量只有326.49的小分子化合物，是只有免疫反應(yīng)性而沒有免疫原性的半抗原，而其免疫原性主要是“苯磺酸”基團。本研究應(yīng)用改良活潑酯法合成突出“苯磺酸”基團的人工免疫原，免疫動物獲得抗“苯磺酸”抗體。以該抗體標記熒光微球，結(jié)合4-氨基苯磺酸合成的突出“苯磺酸”基團的檢測抗原，以多克隆抗體構(gòu)建了針對SDBS的免疫檢測系統(tǒng)，對含有“苯磺酸”基團的化合物具有良好免疫特異性。在餐具中可能存在的帶有“苯磺酸”基團的化合物基本上只有SDBS，所以本免疫體系對餐具殘留SDBS檢測具有良好的可靠性。

通過以抗體標記免疫微球，配合檢測抗原組裝了了免疫熒光微球?qū)游?FICA)試紙條，通過系統(tǒng)優(yōu)化確定對SDBS最低檢測限為100 ng/mL。在實際樣品檢測中，用1000 mL的PBS溶液的充分擦拭提取SDBS殘留量達到0.10 mg/100 cm2的餐具，檢測結(jié)果100%顯示SDBS殘留量超標，證明本研究開發(fā)的熒光免疫層析檢測試劑，能夠按照國家標準(GB14934-2016)規(guī)定的要求，準確判定餐具中SDBS殘留量是否超標。

本研究開發(fā)的檢測苯磺酸類表面活性劑免疫層析方法，展現(xiàn)了靈敏、特異、簡便、快速的特點，是篩查餐具中殘留烷基苯磺酸類表面活性劑的有效工具。