正交實驗法優(yōu)化青翹感冒顆粒的提取工藝*

溫海濤，朱莊松，歐陽潤程，賴 瑜，陳 虹

(梅州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 梅州 514000)

青翹感冒顆粒由連翹、大青葉、車前草、馬鞭草、鬼針草等組成。功效為清熱解表，用于上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽喉炎。現(xiàn)收載于《廣東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》第二冊。由于制法采用水提醇沉工藝，方中藥味所含極性較小的成分沒有充分提取，且有研究顯示醇沉物亦具有一定的藥理活性[1]。為使方中活性成分充分提取，本試驗以方中連翹所含連翹苷、大青葉所含靛玉紅及浸膏得率作為考察指標(biāo)，擬采用正交試驗法優(yōu)化青翹感冒顆粒的提取工藝[2-3]。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；BS110S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；JP080PLUS超聲清洗機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.2 材 料

連翹苷對照品(供含量測定用，批號：110821-202117)中國藥品生物制品檢定所；靛玉紅對照品(供含量測定用，批號：110717-201805)，中國藥品生物制品檢定所；乙腈(Honeywell，色譜純)；水為怡寶飲用純凈水；其他試劑均為分析純；中性氧化鋁(100-200目)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹苷及靛玉紅含量測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜條件：Agilent C18色譜柱(4.6×150 mm，4 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～8 min，20%A；8～9 min，20%～25%A；9～14 min，25%A；14～15 min，25%～50%A；15～23 min，50%A；23～24 min，50%～20%A；24～26 min，20%A)；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長：277 nm，柱溫：30 ℃，流速：1 mL·min-1，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計算不得低于3000。

2.1.2 混合對照品溶液制備

精密稱取連翹苷、靛玉紅對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.1926 mg、0.0618 mg上述對照品的溶液，吸取適量過微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

方中各藥材分別粉碎，過80目篩，按處方比例稱取一定量，置粉碎機(jī)中混合均勻，作藥材粉末備用。取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理20 min。取出，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干。以少量70%乙醇溶解，濕法上樣，置中性氧化鋁柱(100～200目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)，用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干。殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例分別稱取缺少連翹和大青葉的陰性對照樣品，按“2.1.3”項下方法進(jìn)行制備，即得。

2.1.5 專屬性試驗

分別精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，供試品與混合對照品在相同保留時間處有相同的吸收峰，且陰性對照無干擾，本測定方法專屬性良好。結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別取上述5種濃度的供試品，按“2.1.1”項下色譜條件測定，以對照品的峰面積為縱坐標(biāo)，供試品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到連翹苷回歸方程：y=6.1983x+4.0463，R2=1.0000，靛玉紅回歸方程：y=8.147x-2.265，R2=0.9996。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.1926～1.9265 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，靛玉紅進(jìn)樣量在0.0618～0.6175 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得連翹苷、靛玉紅峰面積RSD均小于1.5%，表明儀器日內(nèi)精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，分別在制備后0、1、3、6、12、24 h內(nèi)測定，測得連翹苷、靛玉紅峰面積RSD均小于1.4%，表面供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗

取“2.1.3”項下備用藥粉6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算樣品，結(jié)果，兩種成分的RSD均小于1.0%，顯示本測定方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗

取“2.1.3”項下備用藥粉6份，每份約0.5 g，精密稱定。加入60%乙醇配制的連翹苷、靛玉紅對照品混合溶液(連翹苷0.0354 mg·mL-1，靛玉紅0.0125 mg·mL-1)，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定，連翹苷、靛玉紅平均回收率分別為102.6%、96.3%，RSD分別為2.5%、1.9%。

2.2 浸膏得率的測定

按照《中國藥典》2020年版一部干燥失重法，精密吸取各條件下提取液10 mL，置已經(jīng)干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算浸膏得率。

2.3 青翹顆粒提取工藝研究

2.3.1 單因素試驗

精密稱定備用藥粉，分別對乙醇濃度[0%(水)，30%，60%，70%，95%]、料液比(1:15,1:20，1:25)、提取時間(30、40、50 min)三個單因素進(jìn)行考察，對各條件下所制備的樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 單因素試驗結(jié)果

由表1得，乙醇濃度的變化對兩種成分的溶出影響較大；料液比和提取時間對連翹苷的提取影響較小，對靛玉紅的提取影響較大，分析其原因是由于靛玉紅極性較小，使用60%乙醇提取時，增大料液比或增加提取時間可提高其溶出率。綜合以上試驗結(jié)果，確定以乙醇濃度(60%～80%)、料液比(1:15～1:20)、提取時間(30～50 min)進(jìn)行正交試驗。

2.3.2 正交試驗的設(shè)計

按照L9(34)正交設(shè)計，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素，本試驗以樣品中連翹苷、靛玉紅的含量、浸膏得率及提取液用量為評價指標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)綜合評分[4]，分值分別為4.5、4.5、1分，以各指標(biāo)最大值為參照，綜合評分Y=(X1-X1max)×4.5+(X2-X2max)×4.5+ (X3-X3max)×1。因素水平見表2，設(shè)計結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

由正交試驗結(jié)果及方差分析可知，各因素影響程度依次為A>C>B，因素A有顯著影響(P<0.05)，其他因素?zé)o顯著影響(P>0.05)。綜合上述結(jié)果，確定本試驗的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%；料液比各水平間無顯著差異，從節(jié)約成本的角度考慮選擇1:20作料液比，提取時間為40 min，最終確定本試驗最佳提取工藝為A2B2C2。

2.4 驗證試驗

稱取備用藥粉1.0 g，共三份，精密稱定，加入20倍量70%乙醇，超聲40 min，按上述方法測定，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

本試驗選取連翹苷、靛玉紅及浸膏得率為評價指標(biāo)，與《中國藥典》2020年版收載的連翹和大青葉的相關(guān)質(zhì)量控制指標(biāo)相符，能較全面的評價提取工藝和產(chǎn)品質(zhì)量。

方中主藥大青葉及其指標(biāo)性成分靛玉紅均有有明確的藥理作用[5-6]，原提取工藝為水提醇沉工藝，靛玉紅等極性較小的成分提取率較低，其制劑中未能檢出靛玉紅。結(jié)合組方中其他藥味的化學(xué)成分[7-8]，決定采用醇提法進(jìn)行試驗。

本試驗因?qū)嶒灄l件限制，未對提取次數(shù)進(jìn)行試驗，因此對藥材進(jìn)行粉碎過篩，以期減小實驗誤差，提高其成分的溶出率。結(jié)合中國藥典中連翹[9]、大青葉[10]原藥材的含量測定和正交試驗結(jié)果，方中連翹所含連翹苷提取基本完全，靛玉紅的提取率為原藥材的70%以上。

綜上所述，本試驗對青翹感冒顆粒的提取工藝進(jìn)行了研究，建立了連翹苷、靛玉紅的含量測定方法，為該制劑的提取工藝優(yōu)化提供了理論依據(jù)。