基于理性設(shè)計(jì)提高假交替單胞菌κ-卡拉膠酶熱穩(wěn)定性

龍柳妃，蘇 羽，陳艷紅,2，姜澤東,2，倪 輝,2，李清彪,2，朱艷冰,2,*

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

卡拉膠是從海洋紅藻中提取的一類線性硫酸化多糖[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)內(nèi)是否含有3,6-脫水-D-半乳糖，以及半乳糖上硫酸基團(tuán)的位置和數(shù)量，卡拉膠主要分為3 類：κ-、ι-和λ-卡拉膠[2]。研究表明，κ-卡拉膠降解得到的低分子質(zhì)量卡拉膠寡糖具有更顯著的生物活性[1]，包括抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、植物保護(hù)[6]、抗炎[7]等?？ɡz寡糖制備方法主要包括化學(xué)法和生物酶法，反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)的酶解法由于工藝和產(chǎn)物易于控制，降低環(huán)境污染，同時(shí)保留糖上的硫酸基團(tuán)，具有更好的應(yīng)用性[2,8]。

κ-卡拉膠酶屬于糖苷水解酶家族，是一種通過水解κ-卡拉膠內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵降解卡拉膠的酶[9]。κ-卡拉膠酶主要來源于海洋動(dòng)物和海洋微生物[2]，其中微生物來源包括假單胞菌、假交替單胞菌、噬細(xì)胞菌、弧菌、坦拉氏菌和芽孢桿菌等[10]。κ-卡拉膠酶除用于制備卡拉膠寡糖，還可以用于藻類原生質(zhì)體制備、用作洗滌劑添加劑、用作生物乙醇燃料的生物催化劑、解析卡拉膠多糖的結(jié)構(gòu)等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物燃料等領(lǐng)域[9-10]。

大多數(shù)κ-卡拉膠酶在30～40 ℃范圍內(nèi)顯示出良好的酶活力和溫度穩(wěn)定性[9]，熱穩(wěn)定性不高。在前期研究中克隆、表達(dá)和鑒定了假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶[11]，發(fā)現(xiàn)該酶的熱穩(wěn)定性不高。κ-卡拉膠具有熱可逆凝膠化性能，當(dāng)溫度在55 ℃以下時(shí)，κ-卡拉膠溶液具有很強(qiáng)的黏度，而當(dāng)溫度在55 ℃以上時(shí)，黏度隨溫度升高而降低[12]。因此，在κ-卡拉膠酶的應(yīng)用中，為了提高水解效率，需要κ-卡拉膠酶具有良好的熱穩(wěn)定性。研究具有良好熱穩(wěn)定性的κ-卡拉膠酶對(duì)κ-卡拉膠的高值化利用具有重要意義。

蛋白質(zhì)折疊自由能是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[13]，一些計(jì)算機(jī)算法用于預(yù)測(cè)突變對(duì)蛋白質(zhì)折疊自由能的影響[14-17]。不同酶之間的結(jié)構(gòu)差異使酶結(jié)構(gòu)與功能構(gòu)效關(guān)系復(fù)雜，需要針對(duì)酶的特性進(jìn)行研究。目前尚鮮見改良κ-卡拉膠酶熱穩(wěn)定性的分子改造研究報(bào)道。本研究擬利用基于折疊自由能分析的PoPMuSiC在線服務(wù)器，通過理性設(shè)計(jì)以提高假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶熱穩(wěn)定性，以期擴(kuò)大該酶的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）以及pET-28a載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒小提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、卡那霉素 生工生物工程（上海）股份有限公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖蠱ut ExpressII Fast Mutagenesis Kit V2 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow美國GE Healthcare Life Sciences公司；κ-卡拉膠 深圳恒生生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

雙層全溫度恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；GEAI 600多色熒光凝膠成像儀 美國GE公司；Avanti?J-25冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；Epoch2T微量酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1κ-卡拉膠酶的同源建模及突變位點(diǎn)選取

將假交替單胞菌κ-卡拉膠酶蛋白序列利用SWISSMODEL（http://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，模板為來自Pseudoalteromonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號(hào)5ocq.1.A），覆蓋范圍為2～272位氨基酸，覆蓋率達(dá)68%。將κ-卡拉膠酶的三維結(jié)構(gòu)提交至在線軟件PoPMuSiC[18]，預(yù)測(cè)κ-卡拉膠酶每個(gè)突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG），選擇ΔΔG為負(fù)值并且變化顯著的氨基酸殘基作為突變位點(diǎn)。經(jīng)分析，選擇G113Y、G113C、G113F、G113I、G113W、K155A、K155C、K155I、K155L、K155V作為突變位點(diǎn)。參照Mut ExpressII Fast Mutagenesis Kit V2定點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f明書，依據(jù)選定的擬突變氨基酸位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的引物序列如表1所示。

表1 突變引物Table 1 Primer sequences used for amplification of mutant genes

1.3.2 突變酶重組表達(dá)工程菌株的構(gòu)建

在前期研究中，構(gòu)建了野生型（WT）假交替單胞菌κ-卡拉膠酶重組質(zhì)粒pET-28a-car。利用PCR分別擴(kuò)增得到包含載體序列和突變基因序列的線性片段，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶處理后進(jìn)行消化，消化產(chǎn)物在重組酶催化下將突變位點(diǎn)進(jìn)行重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，利用卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測(cè)序鑒定突變酶基因序列。將含有突變酶序列的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，獲得突變酶重組表達(dá)工程菌株。

1.3.3κ-卡拉膠酶的表達(dá)與純化

分別取WT和突變型κ-卡拉膠酶重組表達(dá)工程菌株的單菌落，37 ℃過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.8后加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)18 h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用預(yù)冷的緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、15 mmol/L咪唑，pH 8.0）懸浮。在冰浴條件下利用超聲波破碎菌體，將裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，獲得的上清液即為粗酶液。參照Ni Sepharose 6 Fast Flow使用說明書，利用親和層析對(duì)κ-卡拉膠酶進(jìn)行分離純化。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析蛋白樣品的純度和分子質(zhì)量。在后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)比較分析中，WT和突變型κ-卡拉膠酶的質(zhì)量濃度保持一致。

1.3.4κ-卡拉膠酶活力測(cè)定

參照張成昊等[11]方法進(jìn)行κ-卡拉膠酶活力測(cè)定。每分鐘釋放1 μmoL半乳糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 溫度對(duì)κ-卡拉膠酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）下測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，研究酶的最適反應(yīng)溫度。將酶分別置于不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）下處理40 min后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6 pH值對(duì)κ-卡拉膠酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別在不同pH值條件下測(cè)定κ-卡拉膠酶活力，研究酶的最適反應(yīng)pH值，所用緩沖液為50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3.0～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～11.0）。將酶分別置于pH 8.0～11.0的緩沖液中，25 ℃放置1 h后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.7 金屬離子對(duì)κ-卡拉膠酶活力的影響

分別添加終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L的不同金屬離子，25 ℃溫浴1 h后，測(cè)定突變?chǔ)?卡拉膠酶的活力，以不加金屬離子的酶活力為100%，研究金屬離子對(duì)突變酶活力的影響。

1.3.8κ-卡拉膠酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別配制不同質(zhì)量濃度的κ-卡拉膠溶液（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.0 mg/mL），測(cè)定酶在不同底物質(zhì)量濃度下的酶活力。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）。

1.3.9κ-卡拉膠酶的結(jié)構(gòu)分析

κ-卡拉膠酶的三維結(jié)構(gòu)使用PyMOL軟件顯示和分析。利用AutoDock Vina軟件進(jìn)行κ-卡拉膠酶與κ-卡拉膠四糖底物的分子對(duì)接。利用Discovery Studio軟件顯示分子對(duì)接后的相互作用力。通過Ligplot軟件統(tǒng)計(jì)顯示κ-卡拉膠酶與κ-卡拉膠四糖結(jié)合狀態(tài)下的疏水氨基酸殘基。利用蛋白質(zhì)相互作用計(jì)算器（Protein Interaction Calculator，PIC，http://pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html）分析κ-卡拉膠酶的分子內(nèi)相互作用。

1.3.10κ-卡拉膠酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用軟件Gromacs進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬分析。使用CHARMM27全原子力場(chǎng)，先進(jìn)行100 ps的NVT平衡和100 ps的NPT平衡，最后進(jìn)行溫度323 K、時(shí)長20 ns的自由分子動(dòng)力學(xué)模擬。蛋白的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）和軌跡中原子位置的均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）分別采用gmx rmsd和gmx rmsf程序計(jì)算，分子的回旋半徑（radius gyration，Rg）則通過gmx gyrate程序計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 κ-卡拉膠酶突變體的構(gòu)建與篩選

將同源建模后的κ-卡拉膠酶結(jié)構(gòu)提交至在線軟件PoPMuSiC，計(jì)算κ-卡拉膠酶每個(gè)突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG）輔助設(shè)計(jì)酶蛋白的定點(diǎn)突變。一般認(rèn)為，ΔΔG為負(fù)值表示突變后能量下降，預(yù)測(cè)酶的穩(wěn)定性提高。根據(jù)突變后每個(gè)突變點(diǎn)ΔΔG的變化，選擇Gly113Try（ΔΔG：-1.35 kcal/mol）、Gly113Cys（ΔΔG：-1.31 kcal/mol）、Gly113Phe（ΔΔG：-1.30 kcal/mol）、Gly113Ile（ΔΔG：-1.00 kcal/mol）、Gly113Trp（ΔΔG：-1.20 kcal/mol）、Lys155Ala（ΔΔG：-0.95 kcal/mol）、Lys155Cys（ΔΔG：-0.92 kcal/mol）、Lys155Ile（ΔΔG：-0.98 kcal/mol）、Lys155Leu（ΔΔG：-1.04 kcal/mol）、Lys155Val（ΔΔG：-1.09 kcal/mol）作為突變位點(diǎn)。將所設(shè)計(jì)的突變體全部進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，突變體和WT的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示，可以看出蛋白條帶清晰且單一，突變體大小為48.8 kDa，與WT一致。測(cè)定κ-卡拉膠酶活力，發(fā)現(xiàn)大部分突變體的酶活力都有不同程度下降，突變體K155A的酶活力與WT相當(dāng)（圖2）。選擇突變體K155A進(jìn)行進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)研究。

圖1 突變體和WT的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of mutants and WT κ-carrageenase

圖2 κ-卡拉膠酶突變體的酶活力Fig. 2 Activities of mutant κ-carrageenases

2.2 溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別測(cè)定WT和K155A的最適溫度，結(jié)果見圖3A。WT的最適溫度為50 ℃，突變體K155A的最適溫度沒有發(fā)生變化。在所有檢測(cè)溫度下，K155A酶活力均不低于WT。酶的熱穩(wěn)定性分析顯示，在40、45、50、55、60 ℃處理40 min后，K155A分別保留了80%、49%、46%、41%、18%的殘余酶活力，而WT分別保留了74%、41%、25%、15%、4%的殘余酶活力，在50、55 ℃和60 ℃處理后，K155A的殘余酶活力分別是WT的1.8、2.7 倍和4.5 倍（圖3B），這些結(jié)果表明，K155A比WT具有更好的熱穩(wěn)定性。通過PoPMuSiC計(jì)算自由能變化輔助設(shè)計(jì)的突變體可能改變酶分子局部區(qū)域氨基酸殘基之間的相互作用，已成為提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或酶活力的有效方法[19]。

圖3 溫度對(duì)K155A和WT κ-卡拉膠酶活力（A）和穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 3 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of K155A and WT κ-carrageenase

2.3 pH值對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響

不同pH值下K155A和WT的酶活力呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，在pH 8.0時(shí)活力均為最高，為最適反應(yīng)pH值，當(dāng)pH值高于8.0時(shí)，K155A和WT的酶活力均急劇降低（圖4A）。酶的pH值穩(wěn)定性分析顯示，在不同pH值條件下處理后，K155A和WT在pH 8.0～11.0范圍內(nèi)殘余酶活力保留在30%以上（圖4B）。

圖4 pH值對(duì)K155A和WT κ-卡拉膠酶活力（A）和穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 4 Effect of pH on the activity (A) and stability (B) of K155A and WT κ-carrageenase

2.4 金屬離子對(duì)酶活力的影響

如圖5所示，高濃度的Na+和K+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用。Ca2+在低濃度下對(duì)酶活力沒有影響，在高濃度下有抑制作用。Mn2+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+和Co2+對(duì)突變酶具有不同程度的抑制作用，其中高濃度的Cu2+對(duì)K155A的抑制作用最顯著。

圖5 金屬離子對(duì)突變?chǔ)?卡拉膠酶K155A活力的影響Fig. 5 Effects of metal ions on the activity of mutant κ-carrageenase K155A

2.5 突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以κ-卡拉膠為底物測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)WT和突變體K155A，Km分別為1.3 mg/mL和1.9 mg/mL，Vmax分別為64.5 U/mg和65.2 U/mg，說明突變導(dǎo)致酶對(duì)κ-卡拉膠的親和力略有下降，Vmax基本沒有差異。

2.6 突變酶的結(jié)構(gòu)分析

將K155A與κ-卡拉膠四糖進(jìn)行分子對(duì)接，分析酶與底物的相互作用機(jī)理。結(jié)果顯示，K155A與κ-卡拉膠四糖的結(jié)合自由能為-13.4 kcal/mol，突變酶的整體結(jié)構(gòu)類似于彎曲的β-三明治，其中β-折疊片兩兩反向堆積形成催化腔，隧道狀結(jié)構(gòu)鑲嵌在三明治狀的結(jié)構(gòu)中，在催化中心位置的隧道內(nèi)裂縫處即為酶的底物結(jié)合處；該突變位點(diǎn)距離活性中心遠(yuǎn)，這可能是該突變體不影響酶活力的原因（圖6A）。催化腔中起催化作用的氨基酸預(yù)測(cè)為E163、D165和E168，其中E163起親核催化作用，E168起酸堿催化作用，D165促進(jìn)中間轉(zhuǎn)換狀態(tài)的解體，催化腔中的精氨酸殘基R260能夠特異性結(jié)合κ-卡拉膠上的硫酸酯基，起著底物識(shí)別的功能[20]。酸堿催化殘基Glu168和親核催化殘基Glu163分布于糖環(huán)兩側(cè)（圖6B、C），Arg151、Trp194、Asn269、Arg196、Ser256、Asp165和His183與κ-卡拉膠四糖形成氫鍵，Tyr64與κ-卡拉膠四糖形成Pi-Sigma型作用力，Try64、Trp67和Trp194與κ-卡拉膠四糖形成Pi-硫型作用力，Arg151和Arg260與κ-卡拉膠四糖形成鹽橋，Tyr161與κ-卡拉膠四糖形成Pi-烷基型作用力（圖6B）。

通過Ligplot軟件統(tǒng)計(jì)κ-卡拉膠四糖與突變酶結(jié)合狀態(tài)下的疏水氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)Trp95、Ile149、Tyr146、Glu163、Tyr64、Trp67、Trp144、Ala142、Glu168、His183、Tyr161殘基與κ-卡拉膠四糖形成了疏水相互作用（圖6D）。將這些殘基對(duì)應(yīng)于三維空間模型，可以發(fā)現(xiàn)它們?cè)讦掠倚淼来呋Y(jié)構(gòu)域底部形成了一個(gè)疏水性口袋，底物被包裹在該口袋中（圖6E）。為了進(jìn)一步探索突變酶的結(jié)構(gòu)變化，利用PIC分析了酶的分子內(nèi)相互作用，κ-卡拉膠酶突變后引入額外的疏水相互作用（表2）。突變體K155A用暴露在溶劑中的疏水殘基Ala取代了WT中的極性殘基Lys，突變后κ-卡拉膠酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的疏水相互作用。突變體K155A的熱穩(wěn)定性提高可能歸因于酶分子內(nèi)疏水相互作用的增強(qiáng)。中溫型和熱穩(wěn)定型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究表明，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性之間存在重要關(guān)系。在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)水平，熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)中存在大量的疏水殘基、帶電殘基、脯氨酸[21-23]。疏水相互作用在蛋白質(zhì)折疊和空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著重要作用[24-25]，是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一，研究表明通過增加蛋白質(zhì)的疏水相互作用提高酶的熱穩(wěn)定性是一種可行的策略[26-27]。

圖6 突變酶K155A與κ-卡拉膠四糖的分子對(duì)接Fig. 6 Molecular docking of K155A with κ-neocarratetraose

表2 K155A和WT κ-卡拉膠酶的分子內(nèi)相互作用Table 2 Intramolecular interactions of K155A and WT κ-carrageenase

2.7 突變酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

對(duì)WT和突變酶進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，RMSD反映出兩個(gè)分子結(jié)構(gòu)相同原子間的距離以及模擬軌跡中蛋白構(gòu)象的變化，用來評(píng)價(jià)體系穩(wěn)定性，若RMSD隨時(shí)間的變化較小，則表明體系達(dá)到平衡狀態(tài)。圖7A顯示了在20 ns模擬過程中RMSD隨時(shí)間變化的結(jié)果，K155A在17.0 ns左右達(dá)到了平衡狀態(tài)，并且維持在0.35 nm左右進(jìn)行波動(dòng)。WT在15.0 ns左右達(dá)到了平衡狀態(tài)，并且維持在0.3 nm左右進(jìn)行波動(dòng)。進(jìn)一步計(jì)算整個(gè)軌跡的RMSF變化，RMSF是指每個(gè)氨基酸殘基在整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的偏振，殘基的位置偏移越大，說明該區(qū)域的構(gòu)象越不穩(wěn)定。如圖7B所示，WT和突變體的大部分殘基RMSF值都小于0.3 nm，而WT 150～250位氨基酸大部分高于突變體，說明突變減小了這些位置的氨基酸柔性，表明突變后酶蛋白的剛性增加，突變酶的剛性增加可能有助于其熱穩(wěn)定性的提高[13]。Rg值可以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在模擬過程中密實(shí)度的波動(dòng)變化，Rg值與蛋白質(zhì)密實(shí)度呈反比關(guān)系。如圖7C所示，κ-卡拉膠酶整體結(jié)構(gòu)的密實(shí)度在突變前后變化不大，說明突變未對(duì)酶的結(jié)構(gòu)造成太大的影響。

圖7 K155A和WT在20 ns的運(yùn)動(dòng)軌跡和結(jié)構(gòu)變化Fig. 7 Motion trajectory and structure changes of K155A and WT within 20 ns

3 結(jié) 論

通過在線預(yù)測(cè)軟件PoPMuSiC成功篩選到假交替單胞菌κ-卡拉膠酶熱穩(wěn)定性提高突變體K155A。該突變酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值與WT相同，K155A對(duì)κ-卡拉膠的親和力略有下降，在pH 8.0～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，在40～60 ℃，突變體K155A的熱穩(wěn)定性優(yōu)于WT酶。酶的結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)模擬分析顯示，突變酶疏水相互作用和剛性的增強(qiáng)可能是其熱穩(wěn)定提高的原因。熱穩(wěn)定性改良提高了該突變?chǔ)?卡拉膠酶在工業(yè)應(yīng)用上的價(jià)值。