文冠果果殼提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性

詹雪嬌

(張掖市甘州區(qū)林業(yè)技術(shù)中心推廣站，甘肅 張掖 734000)

1 引言

植物病原菌屬于主要的果蔬致病菌種，一旦患病，便會(huì)降低種植果蔬的生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量，嚴(yán)重情況下可能會(huì)導(dǎo)致植株的死亡，給種植主體造成較大經(jīng)濟(jì)損失[1]?；瘜W(xué)農(nóng)藥盡管能夠獲得顯著植物病原菌治療效果，但是容易導(dǎo)致食用果蔬農(nóng)藥含量超標(biāo)及自然環(huán)境污染問題。而文冠果果殼提取物中的化學(xué)成分對(duì)于植物病原菌有一定治療效果，有必要強(qiáng)化對(duì)于文冠果果殼的應(yīng)用，從而實(shí)現(xiàn)有效抑菌及殺菌。同時(shí)，文冠果的含油量較為豐富，如果不加以良好應(yīng)用，必然會(huì)造成一定程度的資源浪費(fèi)，可見在植物病原菌預(yù)防及治療中應(yīng)用文冠果果殼提取物，還能夠解決文冠果果殼利用率較低導(dǎo)致的資源浪費(fèi)問題，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于文冠果果殼的靈活應(yīng)用。

2 文冠果化學(xué)成分及生物活性

2.1 文冠果化學(xué)成分

文冠果化學(xué)成分繁瑣復(fù)雜，主要包括三萜類化合物、黃酮類成分、苯丙素類化合物、甾類成分、酚酸類成分、脂肪酸類成分等[2]。

其中，三萜類化合物的骨架及類型較多，主要呈現(xiàn)成苷、成酯或游離狀態(tài)，屬于文冠果果殼、果葉中活性最強(qiáng)的化學(xué)成分之一，具體結(jié)構(gòu)有羽扇豆烷型、甘遂烷型、玉蕊醇型等，通過這些結(jié)構(gòu)還能夠得到其他結(jié)構(gòu)的三萜類化合物。

文冠果中的黃酮類成分主要源自果殼、枝、葉、莖，具體成分包括黃銅、黃烷酮、二氫黃酮、雙黃酮等。

苯丙素類化學(xué)物在文冠果中多為香豆素類化合物，主要包括七葉內(nèi)酯、秦皮苷、秦皮亭、異秦皮亭、東莨菪素、異東莨菪素等。還有少量木脂素類化合物。

文冠果中的甾類成分主要包括菜油甾醇乙酸酯、α-菠菜甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、麥角甾-6、β-谷甾醇、豆甾-7等[3]。

文冠果中的酚酸類成分主要包括原兒茶酸、香草酸、酪醇、對(duì)羥基苯甲醛、原兒茶酸乙酯等。

文冠果中的脂肪酸類成分主要包括二十碳烯酸、山崳酸、軟脂酸、亞麻酸、芥酸、花生酸、豆蔻酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、月桂酸、二十碳二烯酸、木焦油酸、二十四烯酸14種，這是通過分離分析技術(shù)得到的目前最準(zhǔn)確的結(jié)果[4]。但有研究學(xué)者通過GC-MS方法檢測(cè)到了21種脂肪酸類成分，其中有8種脂肪酸類成分是首次在文冠果化學(xué)成分檢測(cè)被報(bào)道和發(fā)現(xiàn)的。

不同研究學(xué)者在文冠果化學(xué)成分研究實(shí)驗(yàn)中，獲得的研究成果有一定區(qū)別，由此出現(xiàn)了文冠果其他化學(xué)成分。例如，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)了1個(gè)生物堿，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)了1個(gè)單萜類衍生物。

2.2 文冠果生物活性

文冠果具有豐富的化學(xué)物質(zhì)，秦皮苷、楊梅苷、花萼片等活性活躍，經(jīng)檢驗(yàn)葉、木提取液，在人類抗炎、抗病毒、抗腫瘤等方面顯著[5]。其中，提取秦皮苷成分，能改善睡眠、緩解痙攣、清熱解毒；楊梅苷可減少人體膽固醇；木提取液成分還可以輔助降低小兒遺尿疾病概率，可見文冠果對(duì)于人體有著顯著生物活性，對(duì)于植物同樣具備良好活性。

3 文冠果果殼提取物植物病原菌抑菌活性研究實(shí)驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)樣品

3.1.1 實(shí)驗(yàn)植物

本次實(shí)驗(yàn)文冠果為自甘肅省野生文冠果，含水量小于5%。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)植物病原菌

實(shí)驗(yàn)植物病原菌主要包括蘋果輪紋病菌、葡萄原斑根腐病菌、番茄灰霉病菌和梨黑斑病菌，上述實(shí)驗(yàn)植物病原菌均來源于某大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室。為了確保植物病原菌抑菌活性研究實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，使用人參皂苷(HPLC超出98%)[6]。

3.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

(1)試劑：檢測(cè)試劑盒為單寧、總酚、炎黃酮類，還配比乙醇/水(75%±5%)(提取物)，而乙酸乙酯、甲醇、高氯酸中，前兩個(gè)作為分析純使用，最后一個(gè)作為優(yōu)級(jí)純使用[7]。供試培養(yǎng)基的制作，具體操作為取馬鈴薯(200 g)，清潔(剝皮)后放入蒸鍋中，鍋內(nèi)添加水800～1000 mL，蒸煮25～30 min后，取出使用紗布(4層)進(jìn)行過濾，放置儀器內(nèi)，先后添加葡萄糖和瓊脂粉分別為20 g，持續(xù)搖晃均勻，待冷卻后再次放入鍋中，將鍋內(nèi)水補(bǔ)加到80～1000 mL，采用三角瓶加以分裝，為包裹瓶口增強(qiáng)嚴(yán)密性，可選用棉塞、報(bào)紙類等物品，實(shí)施高溫滅菌操作，后續(xù)放涼冷卻妥善保存以備實(shí)驗(yàn)使用[8]。

(2)儀器設(shè)備：粉碎機(jī)、電子天平(BSA224S-CW)、循環(huán)冷卻器(DL-400)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52)、循環(huán)水真空泵(SHZ-Ⅲ型)、超聲波清洗劑、光度計(jì)(712G型)、生物光譜計(jì)、水浴鍋、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

3.3 實(shí)驗(yàn)流程

3.3.1 制備文冠果果殼提取物

本實(shí)驗(yàn)選取200目粉碎機(jī)對(duì)文冠果果殼進(jìn)行粉碎處理，而后取約65 g粉末置于1000 mL三角瓶中，緩慢加入400 mL乙醇(本試驗(yàn)所用為75%乙醇-水溶液)[9]。將盛有混合液的三角瓶進(jìn)行封膜處理，而后置于超聲波清洗儀中萃取15～30 min，除去萃取液后在殘?jiān)兄貜?fù)加入400 mL乙醇，而后重新萃取15～30 min?；旌蟽纱屋腿∫豪眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，而后將濃縮液儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑑?chǔ)存溫度以4 ℃為宜。

依照上述方法，取65 g粉末與600 mL乙酸乙酯溶液亦或是石油醚，置于1000 mL三角瓶中，重復(fù)萃取3次，每次萃取均按照上述方法進(jìn)行。第3次萃取之后便能夠得到混合濃縮液，將混合濃縮液蒸干得到乙酸乙酯提取物以及石油醚提取物，儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?chǔ)存溫度以4 ℃為宜[10]。

3.3.2 測(cè)定提取物總酚含量

取0.25 g文冠果果殼提取物置于10 mL離心管中，而后沖入甲醇-鹽酸溶液沖液至8 mL[11]。將溶液置于4 ℃左右的避光環(huán)境中，靜置20 min，平均每7～10 min進(jìn)行一次搖動(dòng)，整體進(jìn)行約2～3次搖動(dòng)，過濾后置于離心管中，得到總分粗提取液。取2 mL粗液進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。

具體檢測(cè)方法如下：取適宜沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與試管中，依照試驗(yàn)需求分別制備0.1、0.3、0.5、1.0 mL對(duì)照組，于每組溶液中加入蒸餾水沖液至1 mL，制備0.1、0.3、0.5、1.0 mL總酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)配置甲醇-鹽酸緩沖液為空白對(duì)照組，置于280 nm的環(huán)境下確定不同溶液的吸光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量[12]。

根據(jù)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)條件推導(dǎo)回歸方程式：y=1.7393x-0.0402。式中，y代表的是吸光值，x代表的是標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)濃度(g/L)。

總酚含量/(g/L)=(C×V)/W。式中，C代表的是基于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的測(cè)定管沒食子酸含量/(g/L)；V代表的是總酚粗提取液總含量，即8 mL，W為提取物總質(zhì)量，即0.25 g[13]。

3.3.3 測(cè)定提取物單寧含量

稱取0.1 g文冠果果殼提取物，混合蒸餾水(1 mL)，攪勻后將溶液置于2 mL離心管中，在80 ℃的水浴環(huán)境中進(jìn)行處理，處理時(shí)間在25～30 min左右，而后置于25 ℃離心環(huán)境中進(jìn)行10 min的離心處理，處理后取上清液備用[14]。

具體檢測(cè)方法如下：在37 ℃的環(huán)境中預(yù)熱磷鉬酸溶液以及氫氧化鈉溶液以待后續(xù)試驗(yàn)使用。取兩支規(guī)格為2 mL的試管，標(biāo)定為測(cè)定管以及對(duì)照管[15]。在測(cè)定管中加入待測(cè)試樣本溶液以及蒸餾水；在對(duì)照管中加入蒸餾水以及磷鉬酸溶液。兩組溶液進(jìn)行5 min靜置處理后，分別加入的氫氧化鈉溶液。單寧這一物質(zhì)在堿性環(huán)境中能夠與磷鉬酸溶液產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而得到藍(lán)色化合物，此時(shí)通過用可見分光光度法，便能夠測(cè)量得到單寧的吸光值，隨后計(jì)算得到單寧的含量值[16]。

根據(jù)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)條件推導(dǎo)回歸方程式：y=0.008x-0.0021，式中，y代表的是吸光值，x代表的是標(biāo)準(zhǔn)單寧酸溶液濃度(mg/L)。此時(shí)，單寧酸溶液含量(mg/L)的計(jì)算公式為：(C×V)/(W×1000)，式中C代表的是單寧酸的含量；V代表的是單寧酸粗提取液的總體積(2 mL)；W代表的是文冠果果殼提取物質(zhì)量，即0.10 g。

3.3.4 測(cè)定提取物類黃酮含量

類黃酮的含量測(cè)定，參照總酚測(cè)定方式，制作甲醇(鹽酸緩沖液)作為對(duì)照，并及時(shí)實(shí)施調(diào)零，確立在325 nm處測(cè)定；根據(jù)計(jì)算公式y(tǒng)=0.004x+0.035(x代表的是蘆丁濃度，y代表的是吸光值)，進(jìn)一步推理出類黃酮含量(mg/g)計(jì)算為(C×V)/(W×1000)，C代表的是蘆丁含量，V代表的是總酚提液(總體積)，W代表的是文冠果果殼提取物質(zhì)量，即0.25 g[17]。

3.3.5 測(cè)定提取物皂苷含量

對(duì)于皂苷含量的測(cè)定，選用人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，添加適量甲醇作為溶劑使用，將其配置為標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.312 g/L)，取試管(6只)，分別進(jìn)行編號(hào)(1～6號(hào))，1號(hào)管吸取0.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，2號(hào)管吸取0.8 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，3號(hào)管吸取1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以此類推，標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取完畢后，另取一支試管(7號(hào))，配置甲醇溶液(1 mL)，進(jìn)行空白對(duì)照，之后加入高氯酸溶液(10 mL)，水浴加熱10～15 mim(65 ℃)，觀察化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后及時(shí)放入冰水放涼冷卻，最后將1～7號(hào)管溶液裝置到比色皿內(nèi)，對(duì)照管則實(shí)施調(diào)零，確立在321 nm出檢測(cè)吸光值，并根據(jù)y=2.437x-0.0914繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(x代表的是皂苷濃度，y代表的是吸光值)。

此時(shí)，再提取乙醇(10 mg)、乙酸乙酯(10 mg)、石油醚提取物(10 mg)，摻加適量甲醇放入燒杯內(nèi)，待溶解后裝置到容量瓶(規(guī)格100 mL)，采取洗滌燒杯的方式(2～3次)，將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中，滴加溶液一直到刻度線位置處，隨后對(duì)配制好的溶液進(jìn)行搖勻處理，進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算[18]。

3.3.6 測(cè)定抑菌活性

根據(jù)二倍稀釋法，將所有實(shí)驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行配置，其中乙醇、乙酸乙酯以及石油醚配置為加藥培養(yǎng)基，其含量為2 g/L。依照1∶10的配比混合培養(yǎng)基后倒平板[19]。依照標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)速率測(cè)定法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)試驗(yàn)。

具體試驗(yàn)流程如下：采用打孔器(規(guī)格為6mm孔徑)在菌絲生長(zhǎng)較為旺盛的區(qū)域進(jìn)行打孔，制備6種菌餅，將取得的6塊菌餅接種至制備好的PAD平板中，而后置于25 ℃的環(huán)境進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每種文冠果果殼提取物都重復(fù)進(jìn)行3次提取，同時(shí)制備無菌水對(duì)照組[20]。在試驗(yàn)進(jìn)行中的1 d、2 d、3 d、4 d后測(cè)量菌落的直徑，同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)公式推算其抑菌率：

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及討論

3.4.1 文冠果果殼提取物化學(xué)成分分析

如表1所示，不同溶劑文冠果果殼提取物中的總酚、單寧、皂苷、類黃酮含量有所區(qū)別。其中，乙醇/水提取物、乙酸乙酯提取物中的類黃酮含量沒有明顯差異，乙醇/水提取物中的總酚、單寧、皂苷含量最高，其次是石油醚提取物，含量差異成倍數(shù)關(guān)系。

表1 文冠果果殼提取物化學(xué)成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì) mg/g

3.4.2 文冠果果殼提取物植物病原菌抑菌活性分析

如圖1所示，不同溶劑文冠果果殼提取物的植物病原菌抑菌活性有所區(qū)別，其中，乙醇/水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。在不同處理時(shí)間段內(nèi)，乙醇/水提取物的植物病原菌抑菌活性比較穩(wěn)定，乙酸乙酯提取物、石油醚提取物抑菌活性在48h之后比較穩(wěn)定。

在24 h處理時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)，乙酸乙酯提取物的蘋果輪紋病菌抑制率為100%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為50%；石油醚提取物的蘋果輪紋病菌抑制率約為100%，時(shí)間不斷延后，抑制率大幅度降低；乙酸乙酯提取物的葡萄根腐病菌抑制率為87%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為46%；石油醚提取物的葡萄根腐病菌抑制率為63%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為27%；乙酸乙酯提取物的山核桃根腐病菌抑制率為75%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為38%；石油醚提取物的山核桃根腐病菌抑制率為75%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為46%；乙酸乙酯提取物的番茄灰霉病菌抑制率為62%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為29%；石油醚提取物的番茄灰霉病菌抑制率為56%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到48 h為9%；乙酸乙酯提取物的番茄枯萎病菌抑制率為50%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為29%；石油醚提取物的番茄枯萎病菌抑制率為0%，時(shí)間不斷延后，抑制率緩慢提高，隨后出現(xiàn)不同程度的降低和提高，到96 h為5%；乙酸乙酯提取物的梨黑斑病菌抑制率為76%，時(shí)間不斷延后，抑制率不斷降低，到96 h為28%；石油醚提取物的梨黑斑病菌抑制率一直處于相對(duì)較低的水平。

圖1 文冠果果殼提取物植物病原菌抑菌活性統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)論

文冠果化學(xué)成分繁瑣復(fù)雜，包括三萜類化合物、黃酮類成分、苯丙素類化合物、甾類成分、酚酸類成分、脂肪酸類成分及其他等。文冠果具有豐富的化學(xué)物質(zhì)，秦皮苷、楊梅苷、花萼片等活性活躍，經(jīng)檢驗(yàn)葉、木提取液，在人類抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面顯著。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇/水提取物對(duì)文冠果果殼化學(xué)成分的提取率最高，且對(duì)于幾種植物病原菌的抑菌活性最高、最穩(wěn)定，這與其他研究文獻(xiàn)得到的最終結(jié)論一致。目前，關(guān)于文冠果果殼提取物植物病原菌抑菌活性的研究大部分停留在實(shí)驗(yàn)層面，很少結(jié)合具體的化學(xué)成分及生物活性，后續(xù)研究還需要向此方向發(fā)展及完善，實(shí)現(xiàn)對(duì)于文冠果的進(jìn)一步研究及應(yīng)用。