miRNA作用于骨折愈合的研究進(jìn)展

王浩宇，任前貴，秦宇星

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

0 引言

骨折的修復(fù)對(duì)人類健康至關(guān)重要，雖然絕大多數(shù)骨折都能正常修復(fù)，但是據(jù)研究表明，5%-10%的患者可能發(fā)生骨折不愈合。骨不連的因素主要有：嚴(yán)重的骨折（如開放性骨折、多發(fā)性骨折）、高體重指數(shù)、吸煙、酗酒。此外男性更容易發(fā)生骨不連。腕舟骨、脛骨、腓骨、股骨骨折最有可能發(fā)生骨不連[1]。骨折愈合過程異常會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合或者不愈合。這會(huì)導(dǎo)致患者增加相關(guān)再手術(shù)的可能性，使患者長期忍受痛苦，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。而且也會(huì)使得病人工作效率降低，收入下降，治療費(fèi)用增加，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)困難。因此我們需要開發(fā)更多有效的方法來治療骨不連。

骨折的修復(fù)過程非常復(fù)雜，其主要通過以下階段：血腫形成、炎癥、膜內(nèi)骨化、軟骨形成、軟骨內(nèi)骨化和重塑[2]。這些多方面的分子和細(xì)胞的共同作用，促使骨的正常形態(tài)和功能的修復(fù)。骨組織在形成時(shí)會(huì)募集多種細(xì)胞因子和炎性因子，這些因子的聚集會(huì)加速骨化、促使新的血管形成，改善軟骨重塑，進(jìn)一步恢復(fù)骨的形態(tài)和生物力學(xué)結(jié)構(gòu)。其中，MicroRNAs作為骨折修復(fù)時(shí)的主要外泌體之一被廣泛關(guān)注。

雖然現(xiàn)在有很多針對(duì)骨折不愈合的物理療法和生物療法（如生長因子、信號(hào)蛋白、骨移植或骨移植替代品等），但仍以手術(shù)治療為主[3]。因此我們急需開展更新的方法來治療骨不連，可以同時(shí)促進(jìn)骨折不愈合并加速骨折的修復(fù)。世界各地的研究學(xué)者們開始著手于一系列的通路信號(hào)、細(xì)胞因子調(diào)控、間充質(zhì)干細(xì)胞等研究[4-6]。而microRNAs就是一種可以納入考慮的替代方法。

1 microRNAs的生物學(xué)機(jī)制

近年來，各研究學(xué)者對(duì)多種microRNAs做出了深入的研究。microRNAs是長度為19-25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，并且由lee等人在研究秀麗線蟲時(shí)首次發(fā)現(xiàn)[7]。miroRNAs是作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，通過引導(dǎo)mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后水平mRNA的翻譯來阻斷其靶基因的表達(dá)[8]。miRNA最初由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為初級(jí)miRNAs(Pri-miRNAs)，長度為數(shù)百到數(shù)千個(gè)核苷酸不等[9-10]。然后由RNaseⅢ內(nèi)切酶 Drosha 和RNA結(jié)合蛋白DGCR8組成的微處理器復(fù)合體（MC）加工，形成長度約為70個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的PremiRNA[11-15]。Pre-miRNA被exportin-5特異性結(jié)合并運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)之中再由RNaseⅢ酶Disher進(jìn)一步加工成短的雙鏈RNA[16-20]。一些調(diào)節(jié)蛋白如TRBP和TACT誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)了Disher引導(dǎo)的切割過程。剪切后成熟的miRNA鏈同Argonaute蛋白結(jié)合并形成RISC（RNA-induced silencing complex）復(fù)合體。在成熟的miRNAs的5′端的一小段核苷酸序列引導(dǎo)下，miRNA-RISC復(fù)合體通過miRNA同mRNA之間形成不全配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)向結(jié)合并調(diào)節(jié)其mRNA的表達(dá)。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，有超過60%的哺乳動(dòng)物基因受到miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[21]，這表明miRNAs可能在某種程度上參與了所有的生物學(xué)過程[21]。許多研究結(jié)果顯示，當(dāng)一個(gè)或者多個(gè)miRNA家族成員在小鼠中被刪除時(shí)，動(dòng)物的很多組織會(huì)發(fā)生異常表型，甚至死亡。同時(shí)其與很多組織,尤其是與肌肉骨骼系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。其可能作為成骨細(xì)胞等的關(guān)鍵調(diào)控因子，與骨質(zhì)疏松癥、骨折修復(fù)和再生有著密不可分的關(guān)系。

2 microRNAs對(duì)成骨細(xì)胞的作用

骨折修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。而其中成骨細(xì)胞作為新骨形成中必不可少的關(guān)鍵調(diào)控細(xì)胞，是需要我們更深入的研究的。我們將對(duì)microRNAs在成骨細(xì)胞中的調(diào)節(jié)進(jìn)行相關(guān)總結(jié)。

2.1 BMPs信號(hào)通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是一類分泌型細(xì)胞因子，屬于TGF-β家族，是一組具有相似結(jié)構(gòu)的高度保守蛋白，在胚胎發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞增殖，遷移和分化過程中起到關(guān)鍵作用[22-29]。BMPs能刺激DNA的合成和復(fù)制，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。BMPs在大多數(shù)的組織分化發(fā)育中都發(fā)揮了重要的作用，尤其在骨骼發(fā)育系統(tǒng)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面被廣泛研究。參與骨骼發(fā)育的主要BMP有BMP-2、-4、-5、-6、-7和它們的拮抗劑Noggin和GremLin,選擇性切除或缺失這些基因會(huì)抑制相應(yīng)組織細(xì)胞的發(fā)育分化[30]。miRNAs在調(diào)控BMP信號(hào)中發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)有相關(guān)研究報(bào)道了miRNAs可以增強(qiáng)BMP信號(hào)。SMAD6屬于smad家族成員，是重要的BMP信號(hào)反饋抑制因子。Smad6優(yōu)先抑制由骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) I 型受體ALK-3 和 ALK-6 引發(fā)的 Smad 信號(hào)傳導(dǎo)[31]。Wang等人研究了microRNA-186通過smad6對(duì)BMP的作用[32]。他們通過數(shù)據(jù)分析預(yù)測證實(shí)了smad6是miR-186的靶基因。通過3D micr-CT對(duì)股骨骨折小鼠模型分組對(duì)照的股骨標(biāo)本進(jìn)行斷層掃描，以評(píng)估骨體積 (BV)、骨體積分?jǐn)?shù) (BVF、BV/TV) 和骨礦物質(zhì)密度 (BMD)，然后進(jìn)行最大負(fù)荷、最大徑向度、彈性徑向度的生物力學(xué)測試，并檢查了 miR-186 水平、信使 RNA (mRNA) 水平和 SMAD6、BMP-2 和BMP-7 的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果顯示，測定的股骨骨折組織中SMAD6陽性表達(dá)，BMD和BV/TV增加。此外，SMAD6陽性表達(dá)組的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，而過表達(dá)的miR-186和SMAD6沉默導(dǎo)致BMP-2和BMP-7水平升高。表明了miR-186 可以激活 BMP 信號(hào)通路，通過靶向 SMAD6 促進(jìn)小鼠骨折愈合，為骨折愈合提供了新的思路。Smad7蛋白能夠拮抗通過Smad途徑傳遞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和TGF-β信號(hào)。Bai等人[33]評(píng)估m(xù)iR-27a 在類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死（ONFH）中的作用，比較了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的血清miR-27a，并對(duì)使用了miR-27a模擬物的大鼠的ALP活性、BMP-2、Runx2 和骨連接素 mRNA 的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，ONFH大鼠血清中miR-27a水平較正常對(duì)照組顯著降低，miR-27a模擬物有效增加了ALP活性，以及BMP-2、Runx2 和骨連接素 mRNA 的表達(dá)。

相反，部分microRNAs對(duì)BMPs也有負(fù)向調(diào)控的作用。Ding等人[34]對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎（AS）的成纖維細(xì)胞成骨分化進(jìn)行了相應(yīng)研究。在這項(xiàng)研究中，從AS和股骨頸骨折患者的囊韌帶中獲取成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定。通過功能獲得和功能喪失、茜素紅S染色和堿性磷酸酶 (ALP) 檢測評(píng)估m(xù)iR-214-3p和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 (BMP2) 在AS成纖維細(xì)胞成骨中的作用。miR-214-3p、BMP2、成骨分化相關(guān)蛋白和 BMP-TGF β進(jìn)一步測量了軸相關(guān)蛋白。最后，在AS成纖維細(xì)胞中miR-214-3p下調(diào)，ALP 活性和鈣結(jié)節(jié)增強(qiáng)。得出了miR-214-3p 可以通過靶向BMP2 和阻斷 BMP-TGFβ軸來阻止 AS 成纖維細(xì)胞的成骨分化的結(jié)論。同樣，有研究表明在成骨分化能力較弱的人類間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）中，成骨標(biāo)記基因在成骨分化中受到miR-125b的負(fù)調(diào)控[35]。miR-125b與BMP受體1B型基因的3’-UTR結(jié)合并抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化?；谶@種負(fù)向調(diào)控，我們可以為骨折愈合開辟新的路徑，例如使用miR抑制劑或者拮抗劑來促進(jìn)骨折愈合。Aafat等人[36]發(fā)現(xiàn)miR-208a-3p水平升高與HLU小鼠全骨樣本中抑制骨形成相關(guān)。體外miR-208a-3p的過表達(dá)抑制成骨細(xì)胞分化，而antagomiR-208a-3p對(duì)miR-208a-3p的沉默促進(jìn)了成骨細(xì)胞活性、骨形成標(biāo)記基因和基質(zhì)礦化的表達(dá)。此外，該研究還表明，antagomiR-208a-3p體內(nèi)預(yù)處理導(dǎo)致骨形成和小梁微結(jié)構(gòu)增加，并部分改善了骨缺損。這些結(jié)果表明體內(nèi)antagomiR-208a-3p抑制miRNA-208a-3p可能是改善骨質(zhì)疏松性骨折的潛在治療策略。絨毛膜和胎盤是MSC的良好替代來源。Marupanthorn發(fā)現(xiàn)[37]BMP-2處理后的細(xì)胞檢測出包括Runx-2、Osx和Ocn在內(nèi)的成骨基因的高表達(dá)，增強(qiáng)了CH-MSCs 和PL-MSCs 的成骨分化潛能。用抗miR31、抗miR106a和抗miR148a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞增加了ALP活性和CH-MSCs 和PL-MSCs 的成骨基因表達(dá)。最后得出抑制特定 miRNAs可能用于增強(qiáng)CH-MSCs 和PLMSCs的成骨分化的結(jié)論。

BMPs同樣也會(huì)受到其他基因或分子的影響。雙糖鏈蛋白聚糖 (Bgn)在Cui等人的實(shí)驗(yàn)中[38]通過miRNA靶預(yù)測數(shù)據(jù)庫被作為候選靶基因。研究者發(fā)現(xiàn)miR-185基因敲除(KO)小鼠的原代成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨的作用。并構(gòu)建了一個(gè)切除卵巢的小鼠模型來研究miR-185在骨質(zhì)疏松癥中的作用。顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描顯示，與手術(shù)后6周的野生型小鼠相比，KO的骨量增加，表明miR-185在骨形成中過多消耗。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測確定雙糖鏈蛋白聚糖(Bgn)在miR-185模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中被顯著的抑制表達(dá)。而相關(guān)研究表明Bgn的GAG鏈在BMP4 誘導(dǎo)的小鼠顱骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化中充當(dāng)啟動(dòng)子[39]。阻斷miR-185表達(dá)會(huì)增加骨質(zhì)疏松癥期間的骨形成，也可能部分通過調(diào)節(jié)Bgn表達(dá)和BMP/Smad信號(hào)傳導(dǎo)而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥中的骨形成。針對(duì)NOG的基因產(chǎn)物noggin是BMP的拮抗劑，對(duì)BMP誘導(dǎo)的成骨分化和骨形成起負(fù)調(diào)控作用[40]。Li等人[41]在研究促進(jìn)人脂肪來源干細(xì)胞（HASCs）成骨時(shí)，發(fā)現(xiàn)BMP-2的過表達(dá)誘導(dǎo)noggin的表達(dá)，而miR-148B的表達(dá)抑制了noggin的表達(dá)，從而緩解負(fù)調(diào)控，改善骨組織愈合。他們使用了一種基于Cre/loxP的桿狀病毒系統(tǒng)用于在HASCs中驅(qū)動(dòng)BMP-2和miR-148B的長時(shí)間過表達(dá)，其中，在不阻礙HASC增殖或引發(fā)明顯細(xì)胞毒性的情況下改善小鼠HASC的成骨。有效修復(fù)顱骨缺損、恢復(fù)骨密度，促進(jìn)骨組織愈合。

BMP信號(hào)也可以通過其受體的表達(dá)來進(jìn)行調(diào)節(jié)。Wang等人[42]分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將其分為對(duì)照組、miR-1組和si-miR-1組，分別轉(zhuǎn)染miR-1質(zhì)粒和miR-1 siRNA，通過MTT法和Caspase 3分析細(xì)胞增殖情況。通過實(shí)時(shí)PCR測量成骨基因Runx2和OPN的表達(dá)。TLR1是miR-1的靶標(biāo)。結(jié)果顯示，miR-1 siRNA轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞miR-1的表達(dá)顯著下調(diào)，成骨基因Runx2、OPN、I型膠原蛋白和BMP-2表達(dá)增強(qiáng)，而TLR1表達(dá)降低了。表明miR-1的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。同時(shí)也證明受體TLR1對(duì)成骨基因的表達(dá)如BMP-2有著相互拮抗的作用。

BMP信號(hào)通路可能是骨折愈合通路中研究最充分的通路，microRNAs與BMPs信號(hào)之間的相互作用也同樣是相關(guān)研究中不可或缺的研究內(nèi)容。rhBMP-2和rhBMP-7是唯一獲得食品和藥物管理局批準(zhǔn)的合成替代品，已應(yīng)用于臨床，用于誘導(dǎo)脊柱融合、骨折愈合。腫瘤切除后的骨缺損miRNA對(duì)BMPs在骨折愈合方面有著上下調(diào)控的關(guān)系，同樣BMPs也對(duì)miroRNAs也起著反饋調(diào)控的作用?，F(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)研究也有著一定的缺陷，很多研究中使用miRNAs轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法來達(dá)到傳遞miRNAs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡便快捷，而缺點(diǎn)也很明顯，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染的最終結(jié)果影響很大，得出的結(jié)果同樣也在不同的實(shí)驗(yàn)中有差異。而且細(xì)胞轉(zhuǎn)染到臨床應(yīng)用方面同樣也很難過渡。對(duì)于miRNA和BMPs信號(hào)通路的研究方法在骨折愈合的臨床應(yīng)用上還有很多進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

2.2 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路

Wnt/β-Catenin是另一種調(diào)節(jié)miRNA的關(guān)鍵信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之中，是一類高度保守的信號(hào)通路。保守的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性，并且在發(fā)育過程中決定細(xì)胞分化的命運(yùn)。經(jīng)典Wnt通路（Wnt/?-catenin）通過抑制?-catenin的復(fù)合物來調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，異常信號(hào)的傳導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[43]。Wnt基因家族可以通過激活和穩(wěn)定下游β-catenin 表達(dá)并誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)來誘導(dǎo)MSC成骨細(xì)胞生成[44]。此外，Wnt直接促進(jìn) Runx2啟動(dòng)子活性并刺激成骨[45]。Zhang等人[46]的一項(xiàng)研究報(bào)告了 miR-335-5p 高表達(dá)促進(jìn)小鼠顱面骨缺損的修復(fù)。他們通過對(duì) miR-335-5p 成骨基因高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的顱骨和長骨進(jìn)行 μCT分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠的成骨細(xì)胞活性和成骨標(biāo)志物如Runx2、Osx、Satb2、ALP、BSP等明顯高于對(duì)照組，而破骨細(xì)胞覆蓋的骨表面百分比在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DKK1（Dickkopf-1）是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的拮抗劑。它通過與LRP5/6受體結(jié)合并使其信號(hào)失活來抑制 Wnt 活性[47]。DKK1表達(dá)的下調(diào)已關(guān)聯(lián)到骨量增加DKK1 蛋白表達(dá)下調(diào)而β-catenin蛋白水平升高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組小鼠的高骨量可能部分是由于 miR-335-5p通過下調(diào)其抑制劑DKK1促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活。

SOX2是一種Wnt的有效抑制因子，在骨折愈合方面有很重要的意義。為了探究MiR-200c作用于wnt信號(hào)成骨分化和骨再生的影響，Adil Akkouch等[48]對(duì)miR-200c做了進(jìn)一步研究來證明其對(duì)成骨分化的影響。miR-200c[49-51]是miR-200家族的成員，最初被報(bào)道可調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能，并已被證明與腫瘤進(jìn)展和侵襲性有關(guān)。miR-200c的過表達(dá)被發(fā)現(xiàn)能有效抑制多種癌癥的進(jìn)展，包括乳腺癌和膀胱癌。miR-200還可以調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展中的Wnt/ β-catenin信號(hào)[52]。最近的研究表明，miR-200c參與成骨分化、牙齒發(fā)育和炎癥（54）。Adil等人通過之前的研究證實(shí)了 miR-200c通過靶向其3’-UTR有效下調(diào)IL-8、 IL-6，并有效改善原代人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中的成骨分化標(biāo)志物。此次研究中，Adil等通過轉(zhuǎn)染編碼 miR-200c的裸質(zhì)粒pDNA過表達(dá)miR-200c，顯著促進(jìn)了hBMSCs中包括堿性磷酸酶、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、骨鈣素和礦物質(zhì)沉積等管控成骨分化的生物標(biāo)志物的產(chǎn)生。研究者又將大鼠隨機(jī)分為三組，接受不同的治療。手術(shù)后六周，收集顱骨并用μCT和組織學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)pDNA 編碼miR-200c顯著增強(qiáng)了大鼠模型顱骨缺損的骨形成和再生。此外，Adil等人發(fā)現(xiàn)在miR-200c過表達(dá)的hBMSCs中可以通過直接靶向3’非翻譯區(qū)并上調(diào)Sox2抑制的Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)活性來下調(diào) Sox2和Klf4。這些數(shù)據(jù)表明，通過過表達(dá)miR-200c可以對(duì) Wnt信號(hào)產(chǎn)生抑制作用并具有促進(jìn)骨折愈合的強(qiáng)大潛力。

通過抑制Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)骨折愈合的miRNA種類很多（如miR-218、miR-367等）[53-54]，它們通過各類通路來對(duì)Wnt產(chǎn)生抑制作用，促進(jìn)骨折的愈合。同時(shí)，它們又有多個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)骨折愈合相關(guān)的多個(gè)通路有著影響作用。miR-21既可以對(duì)Wnt通路進(jìn)行抑制，又可以激活下游AKT和ERK信號(hào)，以此來促進(jìn)骨折愈合。

2.3 PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路

PTEN主要對(duì)PI3K/AKT通路的起著負(fù)性調(diào)控的作用[55]。條件性的敲除PTEN，小鼠的骨形成增強(qiáng)[56]，許多研究表明PI3K/AKT途徑是微調(diào)成骨細(xì)胞分化的途徑網(wǎng)絡(luò)中的中心樞紐[57]。此外，研究還表明，PTEN以及PI3K /AKT途徑的下游介質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[58-59]?？梢姡ㄟ^抑制PTEN可以通過PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路可以調(diào)控成骨作用。

Hongjun Zheng等[60]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a/b-1的過度表達(dá)增強(qiáng)了成骨作用，并且與蛋白質(zhì)合成和線粒體代謝相關(guān)的細(xì)胞途徑顯著上調(diào)。在miR-181a/b-1過度表達(dá)后PTEN水平受到抑制，并且PI3K /AKT信號(hào)隨后增加。PTEN的過表達(dá)減弱了miR-181a/b-1的增強(qiáng)作用，進(jìn)一步證明miR-181a/b-1調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT軸以增強(qiáng)成骨分化和線粒體代謝。

Yang等人[61]采用慢病毒方案構(gòu)建miR-29b-3p轉(zhuǎn)染BMSCs模型和miR陰性對(duì)照BMSCs，然后在體外與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)，以確定EVs包裹的 miR-29b-3p對(duì)HUVECs 增殖、遷移和血管生成的作用。隨后確定了miR-29b-3p、PTEN 的下游靶基因和信號(hào)通路 PI3K/AKT。最后發(fā)現(xiàn)，用 BMSC-EVs治療的小鼠在骨折部位表現(xiàn)出增強(qiáng)的新血管形成，此外還增加了骨體積 (BV)、BV/組織體積和平均骨礦物質(zhì)密度。而miR-29b-3p-BMSCs-EVs處理的小鼠表現(xiàn)出血管密度降低，骨折愈合能力差。結(jié)果表明攜帶 miR-29b-3p的BMSC抑制 PTEN 表達(dá)并激活 PI3K/AKT 通路，從而促進(jìn)相關(guān)成骨細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，最終促進(jìn)骨折愈合。

在骨折愈合過程中，PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路相比前兩者受到關(guān)注更少，相關(guān)研究報(bào)道也相對(duì)匱乏。著重對(duì)相關(guān)通路進(jìn)行進(jìn)一步研究是研究者們下一步需要關(guān)注的重點(diǎn)。

2.4 WWP1、SATB2

WWP1是泛素E3連接酶C2WW-Hect亞家族的成員，已被證明對(duì)成骨細(xì)胞的分化具有負(fù)面影響。YanHong Li等[62]通過培養(yǎng)人BMSC（hBMSC）并用過表達(dá)或敲低KLF2，WWP1和miR-15b的質(zhì)粒處理，以確定衍生的EV在體外成骨分化中的作用。研究了miR-15b、WWP1和KLF2泛素化之間的相互作用。此外，將來自轉(zhuǎn)染了miR-15b抑制劑（EV-miR-15b抑制劑）的hBMSC的EV注射到卵巢切除大鼠中，以驗(yàn)證miR-15b對(duì)體內(nèi)骨質(zhì)流失的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WWP1下調(diào)，KLF2在成骨分化過程中上調(diào)。與EV共培養(yǎng)后，miR-15b表達(dá)升高，WWP1表達(dá)降低。miR-15b或KLF2的上調(diào)或WWP1或NF-κB的下調(diào)增加了ALP活性和細(xì)胞礦化，以及hBMSC中成骨分化相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)。總的來說，裝載了miR-15b的BMSC衍生的EV通過損害WWP1介導(dǎo)的KLF2泛素化和滅活NF-κB信號(hào)通路來促進(jìn)成骨分化。

SATB2屬于一個(gè)特殊的ATrich序列結(jié)合蛋白家族，它與核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合，是許多發(fā)育過程（包括成骨細(xì)胞的分化）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。M Mouillé[63]等通過系統(tǒng)地回顧SABB2相關(guān)綜合征的骨骼表現(xiàn)。他們從2017年到2018年進(jìn)行了一項(xiàng)非干預(yù)性多中心隊(duì)列研究。納入了19名患者，9名女性和10名男性，年齡從2歲到19歲不等。為每位患者前瞻性地收集相關(guān)數(shù)據(jù)包括：臨床數(shù)據(jù)，骨標(biāo)志物以及鈣和磷酸鹽代謝參數(shù)，骨骼X射線和骨礦物質(zhì)密度。結(jié)果提示：SATB2致病變異是骨骼脫礦質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥的原因。發(fā)現(xiàn)骨形成標(biāo)志物水平升高，支持SATB2在成骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用。

關(guān)于miRNA對(duì)骨折愈合的成骨細(xì)胞作用我們分別從BMPs、Wnt/β-Catenin、PTEN/PI3K/AKT、WWP1、SATB2這幾個(gè)方面進(jìn)行論述。我們發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)成骨細(xì)胞分化起著相當(dāng)巨大的作用，有關(guān)研究也層出不窮。但是相關(guān)研究仍然停留在體外實(shí)驗(yàn)的研究，并且各研究方式還相對(duì)不成熟，這主要局限于現(xiàn)今相關(guān)技術(shù)的缺陷?；诖耍P者認(rèn)為當(dāng)相關(guān)新技術(shù)有所突破時(shí)，結(jié)合各研究者進(jìn)行成骨分化進(jìn)一步的研究，必定會(huì)給骨折愈合帶來新的治療方式和治療思路。

3 軟骨形成的miRNA調(diào)控

雖然我們對(duì)于miRNA調(diào)控成骨細(xì)胞研究的很多，但是對(duì)于miRNA調(diào)控軟骨細(xì)胞的相關(guān)研究很少。軟骨形成在骨折愈合中起著至關(guān)重要的作用，軟骨內(nèi)骨化是早期軟骨成骨的關(guān)鍵。

3.1 miRNA對(duì)軟骨形成的正性調(diào)控

在眾多miRNA對(duì)軟骨形成的研究中，miR-140是研究程度最高的。Jun Yang等[64]發(fā)現(xiàn)miR-140在軟骨細(xì)胞中唯一表達(dá)，并被Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)抑制。他們在培養(yǎng)物中敲低miR-140導(dǎo)致軟骨增殖停止。Sp1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p15（INK4b）的激活劑，被確定為miR-140維持軟骨細(xì)胞增殖的靶標(biāo)。miR-520d-5p還通過靶向組蛋白去乙?；?（HDAC1）來促進(jìn)hMSC軟骨細(xì)胞生成并調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝[65]。在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BM-MSCs) 中，早期軟骨形成標(biāo)志物 SOX9、COL2A1和 ACAN 的表達(dá)在轉(zhuǎn)染 miR-127-5p后受到刺激，而在晚期標(biāo)志物 COL10A1 和RUNX2 中表達(dá)降低[66]。因此，miR-127-5p 上調(diào)促進(jìn)軟骨形成，從而防止肥大分化。

3.2 miRNA對(duì)軟骨形成的負(fù)性調(diào)控

同樣，miRNA除了對(duì)軟骨形成具有正性調(diào)控，也具有負(fù)性調(diào)控。Chang等[67]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離并誘導(dǎo)成軟骨分化以在體外模擬軟骨形成。之后使用逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR 檢測了幾種與 SOX9 3'非翻譯區(qū) (UTR) 相互作用的miRNA的表達(dá)水平。通過轉(zhuǎn)染 miRNA 模擬物或抑制劑和熒光素酶報(bào)告基因測定驗(yàn)證候選miRNA和SOX9之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明 miR-30a 和miR-195在MSC成軟骨分化過程中持續(xù)增加。然后，研究者上調(diào)了miR-30a 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) MSC成軟骨分化受到抑制。結(jié)果表明，miR-30a通過靶向SOX9對(duì)MSC成軟骨分化具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

Ming Bai等[68]人通過將miR-182-5p 的模擬物或抑制劑分別上調(diào)或敲低 miR-182-5p 的表達(dá)。通過分析了軟骨形成、免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western bolts、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測表明 PTHLH 是 miR-182-5p 的靶基因之一。進(jìn)一步研究表明，miR-182-5p過表達(dá)下調(diào)SOX-9和COL2A1的表達(dá)，但上調(diào)COL1A1和COL10A1的表達(dá)。一致地，miR-182-5p 敲低具有相反的效果。miR-182-5p 在BM-MSCs 中的這種作用可以通過 PTHLH過表達(dá)來挽救。miR-182-5p可能通過下調(diào)PTHLH在軟骨形成中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

3.3 TGF-β信號(hào)通路對(duì)軟骨形成的影響

TGFβ1，2和3是典型的MSC軟骨生成誘導(dǎo)劑。MicroRNA-193b通過調(diào)節(jié)TGF-βII型受體（TGFBR2）表達(dá)與軟骨生成相關(guān)。Changhe Hou等[69]研究了miR-193b 在軟骨形成和軟骨降解中的作用。螢光素酶報(bào)告基因分析顯示 miR-193b 靶向TGFB2和TGFBR3 3’-UTRs 的種子序列。MiR-193b 抑制軟骨形成 ATDC5 細(xì)胞中早期軟骨形成標(biāo)志物的表達(dá)，以及 IL-1b 誘導(dǎo)的 PMC 中 TNF-α 的表達(dá)。最后得出結(jié)論，miR-193b 可能通過靶向TGFB2 和 TGFBR3 來抑制早期軟骨形成。

3.4 VEGF在軟骨形成中的調(diào)控

通過VEGF正向調(diào)節(jié)軟骨形成的miRNA能夠在早期軟骨形成中抑制VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）和成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR1)[70]。PTEN 可以通過靶向相互作用被 miR-107 負(fù)調(diào)控。PTEN的干擾誘導(dǎo)C28/I2細(xì)胞增殖，但抑制細(xì)胞凋亡。PTEN的恢復(fù)逆轉(zhuǎn)了 C28/I2細(xì)胞中 miR-107 刺激的細(xì)胞增殖和 miR-107 抑制的細(xì)胞凋亡。Feng Tian等[71]發(fā)現(xiàn)PTEN 可以通過靶向相互作用被miR-107 負(fù)調(diào)控。PTEN的干擾誘導(dǎo)C28/I2細(xì)胞增殖，但抑制細(xì)胞凋亡。PTEN 的恢復(fù)逆轉(zhuǎn)了 C28/I2細(xì)胞中 miR-107 刺激的細(xì)胞增殖和miR-107 抑制的細(xì)胞凋亡。且miR-107 的上調(diào)抑制血管生成和 VEGF 表達(dá)并促進(jìn) ACAN 和COL2A1 表達(dá)，減弱 C28/I2細(xì)胞中 MMP-13和 MMP-9 的表達(dá)。

另一種負(fù)向調(diào)節(jié)軟骨形成的miRNA是miR-29a，它通過與VEGF mRNA的3'-UTR結(jié)合來靶向VEGF的mRNA 。還研究了VEGF和抗血管生成 miR-20a、miR-106a-5p 和 miR-20b。MiR-20a 是一種關(guān)鍵的軟骨分化負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過靶向自噬相關(guān) 7 (Atg7)[72]。 MiR-193b 下調(diào) COL2A1、ACAN 和 SOX9 等因子，同時(shí)靶向二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)VEGF分泌減少[73]。

4 總結(jié)與展望

骨折愈合是極其復(fù)雜的過程，相關(guān)的研究每年更新極快。雖然miRNAs在很早以前就被發(fā)現(xiàn)，但是近幾年我們才對(duì)其作用于骨折愈合的重要性有所關(guān)注。BMPs、Wnt/β-Catenin信號(hào)通路是miRNAs對(duì)成骨細(xì)胞影響的主流。但是，我們也同時(shí)針對(duì)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路、WWP1、SATB2細(xì)胞因子對(duì)成骨作用的影響做了相關(guān)的闡述。這些信號(hào)通路和相關(guān)的細(xì)胞因子同樣對(duì)骨折愈合有著不可或缺的影響。miRNA對(duì)軟骨細(xì)胞分化的影響的相關(guān)研究大多數(shù)都集中在骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究之中，對(duì)骨折愈合方面的相關(guān)報(bào)道并不多。但是軟骨的形成是骨折愈合過程中不可或缺的重要一環(huán)，相關(guān)研究的關(guān)注點(diǎn)應(yīng)該更多的著重于軟骨方面的研究。近年來，miRNA對(duì)骨折愈合方面的研究正在逐步增加，這必將為骨折愈合提供一系列新方法和新途徑。