三種獸用消毒劑對偽狂犬病病毒的滅活效果研究

董建斐，張 璐，王雅婷，徐 輝，趙靈燕，謝榮輝

(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310018)

自2018年我國發(fā)生非洲豬瘟以來，生物安全措施迅速得到提升，消毒劑使用不斷增加，但各種消毒劑對非洲豬瘟病毒消毒效果還有待于進(jìn)一步評估研究。豬偽狂犬病病毒和非洲豬瘟病毒均為DNA病毒，兩者分子結(jié)構(gòu)和理化特性非常相似，其中豬偽狂犬病病毒能在多種細(xì)胞中增殖，是一個很好的模式病毒[1]，由于非洲豬瘟屬于高致病性動物病原微生物，許多實驗室因生物安全級別不夠不能開展病毒培養(yǎng)和消毒效果的研究，同時消毒劑對偽狂犬病病毒消毒效果的評價，也可在實際生產(chǎn)過程中為非洲豬瘟消毒劑的選擇和使用提供依據(jù)。

目前雖然豬偽狂犬病疫苗大規(guī)模使用于養(yǎng)殖場，并有效地遏制了偽狂犬病的暴發(fā)和區(qū)域化流行，但仍有疫苗免疫豬場發(fā)生豬偽狂犬病[2-6]，徹底根除和凈化豬偽狂犬病還需采取消毒等生物安全措施。當(dāng)前仍有許多養(yǎng)殖場使用消毒劑作為預(yù)防和控制偽狂犬病等病毒性疫病發(fā)生的主要手段之一。為了正確指導(dǎo)豬偽狂犬病病毒消毒工作，消毒劑的選擇至關(guān)重要。本試驗旨在對常用獸用消毒劑滅活偽狂犬病病毒的效果進(jìn)行評價，為臨床應(yīng)用提供常用獸用消毒劑稀釋濃度和消毒效果數(shù)據(jù)。以GFP標(biāo)記的gE/TK雙基因缺失的偽狂犬病病毒為模式病毒，評估了碘酸混合液、戊二醛癸甲溴銨溶液和二氯異氰尿酸鈉3種獸用消毒劑對偽狂犬病病毒的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1試驗材料 試驗用消毒劑碘酸混合液(20200404)、戊二醛癸甲溴銨溶液(20200204)和二氯異氰尿酸鈉(20190410)均為國內(nèi)市售產(chǎn)品。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、鏈霉素和青霉素雙抗溶液均為Gibco產(chǎn)品。GFP標(biāo)記的gE/TK雙基因缺失的偽狂犬病病毒(以下簡稱重組偽狂犬病弱病毒)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2試驗方法

1.2.1重組偽狂犬病弱病毒擴(kuò)增和病毒懸液制備 吸取0.1 mL病毒液至生長有單層BHK21細(xì)胞的75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入30 mL含3%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變和細(xì)胞中的綠色熒光，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%-90%時，將培養(yǎng)瓶置于-80 ℃凍融三次，1000 rpm離心10 min，吸取上清后加入胎牛血清使病毒液中的胎牛血清達(dá)到10%，病毒液分裝于2 mL保存管，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組偽狂犬病弱病毒滴度測定 將擴(kuò)增后的重組偽狂犬病病毒用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，分別接種于生長有單層BHK21細(xì)胞(96孔板)中，每個稀釋度接種8孔，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光，連續(xù)觀察5 d，按Reed-Muench法計算該病毒的半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)。

1.2.3病毒滅活試驗 試驗組用PBS將消毒劑稀釋成不同濃度，取重組偽狂犬病病毒液與等量不同濃度的消毒劑混合，分別在室溫(24 ℃)、37 ℃和4 ℃環(huán)境下作用一定時間(2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 40 min)后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋100倍，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出并用PBS洗二次，將上述稀釋好的消毒劑與病毒混合液加入相應(yīng)孔(24孔板)中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附1-2 h，然后將液體吸出，PBS清洗二次后加入含3%胎牛血清的DMEM溶液，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在熒光顯微境下觀察細(xì)胞中的熒光。陽性對照組為200倍稀釋的重組偽狂犬病病毒液，消毒劑為最高濃度消毒液經(jīng)100倍稀釋后與等量100倍稀釋后的混合液。陰性對照組為經(jīng)200倍稀釋后的最高濃度的消毒劑。

1.2.4滅活率計算 病毒滅活率=[(對照組病毒含量-消毒劑組病毒含量)/對照組病毒含量]×100%。若消毒劑滅活病毒不徹底，則按1.2.2方法測定滅活前后病毒的TCID50的變化計算滅活率。

2 結(jié)果

2.1戊二醛癸甲溴銨溶液對偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下0.2%戊二醛癸甲溴銨溶液與偽狂犬病病毒作用5 min，就可將其完全滅活；而在低溫環(huán)境下，0.2%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用40 min仍未能徹底滅活病毒，表明該消毒劑受溫度的影響較大。

表1 戊二醛癸甲溴銨溶液對偽狂犬病病毒滅活效果

2.2碘酸混合溶液對偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下0.05%的碘酸混合溶液作用10 min方可完全滅活偽狂犬病病毒，但37 ℃環(huán)境下0.05%的碘酸混合溶液5 min即可完全滅活偽狂犬病病毒。由于0.1%和0.2%的碘酸混合液對細(xì)胞毒性較大，接種消毒劑和病毒混合液后細(xì)胞脫落和發(fā)生淍亡，無法判定病毒的感染狀況。

2.3二氯異氰尿酸鈉對偽狂犬病病毒的滅活效果 結(jié)果顯示，在常溫(20 ℃)下，有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用20 min可完全滅活偽狂犬病病毒，而在37 ℃環(huán)境下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用10 min即可完全滅活偽狂犬病病毒，在4 ℃環(huán)境下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液作用40 min仍未完全滅活偽狂犬病病毒，表明該消毒劑對病毒的滅活效果受溫度影響。

表2 碘酸混合溶液對偽狂犬病病毒滅活效果

表3 二氯異氰尿酸鈉溶液對偽狂犬病病毒滅活效果

3 討論

目前市場所售的獸用消毒劑可分為鹵素類消毒劑、氧化劑類消毒劑、醛類消毒劑、醇類、酚類消毒劑、酸堿類消毒劑和表面活性劑類消毒劑等多種類型的消毒劑[7]，其中以鹵素類、醛類和酸堿類消毒劑最為常用。本研究選用養(yǎng)殖場常用的3種三類獸用消毒劑，并分別評估了其對偽狂犬病病毒的滅活效果。

戊二醛癸甲溴銨溶液是一種新型復(fù)方消毒劑，癸甲溴銨為雙鏈季銨鹽消毒劑，其季銨陽離子與病原體胞漿膜磷脂中帶負(fù)電荷的磷酸基結(jié)合，使其通透性改變，此外其對親脂性病毒也有一定作用,可協(xié)同戊二醛更易進(jìn)入病毒內(nèi)部，破壞蛋白質(zhì)和酶活性，溴離子使分子的親水性和親脂性增強，達(dá)到快速高效的消毒作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在常溫和37 ℃下0.2%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用5 min可將偽狂犬病病毒完全滅活，這與說明書推薦的在疫情發(fā)生時所用消毒濃度(0.1%-0.2%)相符。而在低溫環(huán)境下，作用30 min仍未將病毒滅活，表明該消毒劑消毒效果受到環(huán)境影響較大，應(yīng)引起重視。研究顯示該消毒劑對不同種類病毒的滅活效果存在差異。有研究顯示常溫下濃度為0.01%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用20 min可在體外完全殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒[9]，0.1%戊二醛癸甲溴銨溶液作用30 min可將H7N9亞型流感病毒完全滅活[10]，而本研究顯示0.1%的戊二醛癸甲溴銨溶液作用30 min卻不能完全滅活偽狂犬病病毒，表明針對不同病原體應(yīng)選擇合理的作用濃度，必要時需增加消毒劑的濃度。

二氯異氰尿酸鈉由于殺菌消毒能力強，毒性低和穩(wěn)定性高，目前已廣泛使用于養(yǎng)殖業(yè)。其主要作用原理為使病原體蛋白質(zhì)變性，改變膜通透性，干擾酶系統(tǒng)生理生化及影響DNA合成等過程，使病原體死亡。研究顯示該消毒劑對不同病毒的滅菌效果存在著差異，有效氯濃度為100 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min可完全滅活豬圓環(huán)病毒2型[11]，有效氯濃度為25 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min即可完全滅活豬粘病毒[12]，本研究顯示在常溫下有效氯為300 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用30 min方可完全滅活偽狂犬病病毒。研究顯示常溫下有效氯為200 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min對偽狂犬病病毒滅活率大于99.99%，與生產(chǎn)商疫源地消毒推薦濃度為200 mg/L相符。但在4 ℃環(huán)境下有效氯為200 mg/L的二氯異氰尿酸鈉作用10 min對偽狂犬病病毒的滅活率只有99.98%。按照國內(nèi)消毒劑檢測規(guī)定，用殺滅率來表示消毒效果時，消毒劑對病毒殺滅率須大于99.99%才為消毒合格，應(yīng)引起重視。本試驗中的病毒是完全浸泡在一定濃度下的消毒劑中，與實際應(yīng)用環(huán)境有所差別，為確保消毒效果在低溫狀況下應(yīng)適當(dāng)增加二氯異氰尿酸鈉的濃度。因此，在低溫環(huán)境下對存在偽狂犬病病毒等抵抗力較強的病原體的疫源地消毒時推薦使用有效氯為400 mg/L的二氯異氰尿酸鈉溶液。

碘酸混合液主要通過碘化和氯化酶體蛋白活性基團(tuán)，并與蛋白的氨基結(jié)合而導(dǎo)致蛋白變性和抑制菌體的代謝酶系統(tǒng)。本研究顯示按說明書推薦濃度使用1：300倍稀釋使用時，在低溫和常溫下均可迅速滅活豬偽狂犬病病毒，具有良好滅活效果,但在1：100和1：200倍稀釋的狀況下對細(xì)胞的毒性較大，接種消毒劑與病毒混合液后，細(xì)胞易脫落和凋亡,難以觀察病毒感染細(xì)胞的狀況，從理論上濃度高的消毒劑更易滅活病原體，但在對活體皮膚等消毒時應(yīng)引起重視，避免應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。

本研究結(jié)果為實驗條件下得出的結(jié)果，在養(yǎng)殖業(yè)實際使用過程中由于受糞便等有機物的干擾，其消毒效果可能有所降低。因此，在養(yǎng)殖場進(jìn)行消毒前應(yīng)先進(jìn)行清掃和沖洗，減少有機物的干擾以提高消毒劑對病原微生物的滅活作用，并且在冬季等低溫天氣應(yīng)適當(dāng)提高消毒劑濃度和作用時間。