具有抗炎和促干細(xì)胞活性雙效應(yīng)評(píng)價(jià)功能的新型結(jié)腸炎小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用

鮑維廉 尤科淵 馮桂澤 曹心悅 沈曉燕

（復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室 上海 201203）

實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明，腸黏膜屏障功能受損是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的驅(qū)動(dòng)因素［1-3］。研究已將黏膜愈合作為IBD治療的關(guān)鍵目標(biāo)，意味著患者腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能可完全修復(fù)，預(yù)示著患者臨床癥狀持續(xù)緩解和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)降低［4］。目前治療IBD的藥物［5-6］主要用于控制免疫炎癥，對(duì)于黏膜損傷的修復(fù)非常有限，在以黏膜愈合為主要終點(diǎn)的臨床試驗(yàn)中，藥效仍不能令人滿(mǎn)意［7-9］。因此，尋找既能控制炎癥又能促進(jìn)黏膜愈合的新靶標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)治療IBD的新藥物成為迫切需要解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。

在腸隱窩底部的Lgr5+細(xì)胞群具有成體干細(xì)胞潛能的腸干細(xì)胞（intestinal stem cell，ISC），可以在黏膜受損的情況下完成上皮系統(tǒng)的更新。在IBD患者中，Lgr5+ISCs的減少與疾病活動(dòng)相關(guān)［10-13］。ISCs的丟失和功能異常是IBD慢性、反復(fù)發(fā)作性炎癥的重要因素［14］。而將ISCs移植到實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物的黏膜損傷部位，可以加速黏膜愈合［15-17］。Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠可以完成對(duì)ISCs的示蹤和分選。該小鼠攜帶Lgr5-EGFP-IRESCreERT2基因敲入型等位基因，破壞了內(nèi)源Lgr5（Gpr49）基因功能，并表達(dá)來(lái)自L(fǎng)gr5啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP和CreERT2融合蛋白。該轉(zhuǎn)基因小鼠純合子不能存活，但是Lgr5-EGFP-IRESCreERT2雜合小鼠可存活且可繁育。在該種小鼠的腸隱窩基底柱狀細(xì)胞（即ISCs）中可觀(guān)察到EGFP熒光。Cre-ERT2融合蛋白由Cre重組酶和三重突變形式的人雌激素受體組成，該受體可與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結(jié)合。由于HSP90的阻擋，雌激素受體結(jié)合的融合蛋白無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核。雌激素和雌激素受體結(jié)合使融合蛋白擺脫HSP90，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮Cre酶活性。生理濃度下，受體與其天然配體（17β-雌二醇）不發(fā)生結(jié)合，但會(huì)與合成的雌激素受體配體4-羥基他莫昔芬或他莫昔芬結(jié)合，故可以通過(guò)注射他莫昔芬實(shí)現(xiàn)對(duì)Cre酶系統(tǒng)的控制。Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠與攜帶loxP側(cè)翼序列的小鼠雜交獲得的雙基因敲除小鼠受他莫昔芬誘導(dǎo)后，Cre酶介導(dǎo)的重組導(dǎo)致后代中表達(dá)Lgr5的細(xì)胞中l(wèi)oxP位點(diǎn)間的基因序列被敲除。如果沒(méi)有flox基因片段的存在，Lgr5-EGFP-IRES-creERT2僅 發(fā) 揮 對(duì)Lgr5陽(yáng) 性細(xì)胞的熒光示蹤功能，其熒光強(qiáng)度在一定程度上可以表征小鼠腸黏膜屏障的自我修復(fù)能力。

Il10基因敲除小鼠是一種廣泛使用的結(jié)腸炎模型［18］。Il10-/-小鼠通常在8～12周齡開(kāi)始發(fā)生漸進(jìn)的、不連續(xù)的透壁型炎癥，炎癥從右結(jié)腸開(kāi)始，隨著疾病進(jìn)展向遠(yuǎn)端延伸，可累積小腸；同時(shí)出現(xiàn)明顯的IBD癥狀，如體質(zhì)量下降、稀便、便血、脫肛等。發(fā)病機(jī)制與人類(lèi)IBD相似，病情呈漸進(jìn)式發(fā)展，可用于早期干預(yù)研究，是研究IBD的理想模型。

本研究中，我們用Il10-/-小鼠和Lgr5-EGFP小鼠雜交得到Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠。該基因型小鼠經(jīng)誘導(dǎo)形成慢性結(jié)腸炎模型，可以同時(shí)評(píng)價(jià)藥物對(duì)炎癥活動(dòng)和干細(xì)胞活性的影響。成功建立這一模型可為結(jié)腸炎潛在藥物/治療手段的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供一個(gè)可靠的雙靶點(diǎn)驗(yàn)證的動(dòng)物模型。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)gr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-EGFP）和B6.129P2-Il10tm1Cgn/J（Il10-/-）小鼠均引進(jìn)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，引進(jìn)后擴(kuò)群繁殖，并將兩種基因型小鼠雜交繁殖。繁殖過(guò)程中所有小鼠均飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2014-0002。溫度（25±2）℃，濕度50%～60%，無(wú)菌飲水，自由進(jìn)食和飲水，保持12 h光-暗循環(huán)。經(jīng)鑒定得到目標(biāo)基因型小鼠Il10-/-；Lgr5-EGFP及其對(duì)照基因型小鼠WT；Lgr5-EGFP。進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的小鼠均為雄性，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)條件同上。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：2019-03-YL-SXY-01）。

小鼠的基因鑒定取3周齡小鼠，按性別分籠并剪鼠耳標(biāo)記，剪3～5 mm鼠尾，提取DNA，對(duì)小鼠基因型進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)于Lgr5-EGFP，根據(jù)待測(cè)樣 品 數(shù)，將 表1中 的3種 引 物 以 每 份0.6、0.5和0.8 μL的體積混合，加入5×樣本體積的2×PCR Mix和1.1×樣本體積的DEPC水，制成鑒定工作液。將8 μL鑒定工作液加入2 μL DNA樣本中，得到完整的鑒定反應(yīng)體系，置入PCR儀中，按照表2中的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到鑒定產(chǎn)物1。對(duì)于Il10，根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)，將表3中的3種引物以每份1.0、0.5和0.5 μL的體積混合，加入5×樣本體積的2×PCR Mix和1×樣本體積的DEPC水，制成鑒定工 作液。將8 μL鑒定 工 作液 加 入2 μL DNA樣 本中，得到完整的鑒定反應(yīng)體系，置入PCR儀中，按照表4中的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到鑒定產(chǎn)物2。對(duì)鑒定產(chǎn)物1和2進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)最終條帶所對(duì)應(yīng)的Marker判斷分子量，進(jìn)而判斷基因型。每只小鼠的DNA樣本將進(jìn)行3次以上獨(dú)立的PCR及凝膠電泳，確保結(jié)果可靠。

表1 Lgr5-EGFP小鼠DNA鑒定引物序列Tab 1 Primers for DNA identification of Lgr5-EGFP mice

表2 Lgr5-EGFP小鼠DNA鑒定的擴(kuò)增反應(yīng)Tab 2 Amplification reaction for DNA identification of Lgr5-EGFP mice

表3 Il10-/-小鼠鑒定PCR引物Tab 3 Primers for DNA identification of Il10-/-mice

表4 Il10-/-小鼠鑒定的擴(kuò)增反應(yīng)Tab 4 Amplification reaction for DNA identification of Lgr5-EGFP mice

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)取6只8周齡雄性WT；Lgr5-EGFP基因型小鼠作為對(duì)照組；Il10-/-；Lgr5-EGFP基因型小鼠共計(jì)18只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：模型組、美沙拉嗪低劑量組和高劑量組，每組6只。模型組及給藥組給予飲用水配制的3% DSS溶液4天，在SPF環(huán)境下誘導(dǎo)結(jié)腸炎，每2天換一次DSS溶液，對(duì)照組小鼠正常飲水。美沙拉嗪采用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，發(fā)病后開(kāi)始灌胃給藥，低劑量組為50 mg·kg-1·d-1，高劑量組為150 mg·kg-1·d-1，每周記錄小鼠體質(zhì)量，觀(guān)察并記錄小鼠稀便、血便、脫肛和體質(zhì)量減輕等情況，根據(jù)表5進(jìn)行評(píng)分。7周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，分離各實(shí)驗(yàn)樣本，進(jìn)行檢測(cè)。

表5 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 5 Criteria of disease activity index scoring

ELISA檢測(cè)小鼠炎癥因子使用水合氯醛麻醉小鼠，壓迫眼球，使眼球突出，用鑷子或止血鉗迅速摘除眼球并處死。獲得的外周血在室溫靜置2 h后，4℃下3 000×g離 心15 min，上 清 即 為 血 清，-80℃冰箱儲(chǔ)存。使用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子，并根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通用步驟按濃度梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔（包括空白和標(biāo)準(zhǔn)品）數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目；每孔加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，空白孔為稀釋液；加入一抗工作液或直接用膜封板，37℃孵育2 h；加入洗滌液洗滌，在濾紙上倒扣去除殘留液體，重復(fù)3次。加入酶標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min；每孔加入漂洗液150 μL，洗板，扣去殘留液體，重復(fù)3次；加入現(xiàn)配的TMB顯色液，37℃孵育10～30 min，加入終止液，停止反應(yīng)；反應(yīng)終止后10 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)得OD值；根據(jù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將待測(cè)樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品濃度。

RT-qPCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織mRNA分離獲得小鼠結(jié)腸樣本，用無(wú)菌PBS沖洗結(jié)腸，去除腸腔內(nèi)糞便。剪碎結(jié)腸組織，用組織勻漿機(jī)打碎，加入Trizol，離心取上清，室溫靜置10 min。向完成裂解的樣本中加入200 μL（Trizol體積的1/5）氯仿，劇烈振搖15 s，靜置2～3 min；分層后，4℃下12 000×g離心15 min，吸取最上層水相（400～500 μL），轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的EP管中。加入等體積（400～500 μL）異丙醇，輕柔顛倒，靜置10 min，可見(jiàn)白色絮狀物。4℃下2 000×g離心10 min，棄去上清。加入1 mL DEPC水和無(wú)水乙醇現(xiàn)配的75%乙醇，槍頭吹打混勻，洗滌沉淀，7 500×g離心5 min，棄上清，用移液槍吸盡殘留液體。通風(fēng)櫥內(nèi)室溫干燥5～10 min，根據(jù)沉淀體積加入適量DEPC水溶解RNA。使用Nano Drop 2000（美 國(guó)ThermoFisher公 司）檢 測(cè)RNA濃度，調(diào)整各樣本至同一濃度范圍。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR-qPCR試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)，qPCR的引物如表6所示。

表6 qPCR引物序列Tab 6 Primer sequences for qPCR

冰凍切片的制作和DAPI染色去除小鼠結(jié)腸的內(nèi)糞便，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。將組織先后置于15%和30%的蔗糖溶液內(nèi)，在4℃冰箱中脫水。濾紙濾干脫水的組織，將目的部位修平，切面朝上放于樣本托中，OCT包埋劑滴至周?chē)糜诒鶅銮衅瑱C(jī)的速凍臺(tái)上，直至OCT凝固，切片，切片厚度8～10 μm，于-20℃保存。載玻片用PBS（pH=7.4）洗滌3次。晾干，DAPI染色10 min，滴加含抗熒光淬滅劑的封片劑，封片。于Zeiss 710熒光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖，所有數(shù)據(jù)用±s表示。血清炎癥因子、結(jié)腸炎癥因子mRNA表達(dá)和結(jié)腸部位Lgr5+ISCs觀(guān)察的定量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，并采用Bonferroni法進(jìn)行組間比較；小鼠體質(zhì)量比較采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，并采用Bonferroni法進(jìn)行組間比較；小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的比較采用Kruskal-Wallis分析，并采用Dunn’s法進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠基因鑒定對(duì)小鼠鼠尾提取的基因組DNA，使用特定的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)所示條帶（圖1）判斷小鼠的基因型。Lgr5-EGFP基因在174和298 bp處都有清晰條帶，為L(zhǎng)gr5-EGFP雜合子小鼠。Il10基因僅在137 bp處有清晰條帶，為WT小鼠；Il10基 因 僅 在312 bp處有清晰條帶，為Il10-/-純合子小鼠。①～⑥號(hào)小鼠的基因鑒定結(jié)果（圖1）：③號(hào)（泳道3和9）和⑤號(hào)（泳道5和11）為WT；Lgr5-EGFP小鼠，②號(hào)（泳道2和8）為Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠。

圖1 小鼠基因型鑒定Fig 1 Genotype identification of mice

美沙拉嗪有效緩解Il10-/-；Lgr5-EGFP模型的體質(zhì)量下降和疾病評(píng)分對(duì)Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠進(jìn)行持續(xù)4天的3% DSS誘導(dǎo)，可在SPF環(huán)境下形成慢性結(jié)腸炎模型。為驗(yàn)證該模型，我們?cè)O(shè)置了WT；Lgr5-EGFP小鼠的對(duì)照組和長(zhǎng)期給予50或150 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪的治療組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)，飲食、飲水正常，精神狀態(tài)佳，活動(dòng)頻繁，糞便形態(tài)未見(jiàn)明顯異常；以開(kāi)始給予DSS誘導(dǎo)為第0周，模型組小鼠在誘導(dǎo)后前2周體質(zhì)量驟降，第3周體質(zhì)量略有恢復(fù)，第4周開(kāi)始體質(zhì)量再次持續(xù)下降，飲食少，食欲差，精神狀態(tài)萎靡，出現(xiàn)腹瀉、肉眼血便、膿便等癥狀。而相比于模型組，治療組體質(zhì)量下降減緩，小鼠稀便和血便情況明顯減少，各項(xiàng)癥狀得到明顯改善。結(jié)果顯示（圖2），在體質(zhì)量變化和疾病活動(dòng)評(píng)分上，全程模型組和對(duì)照組都存在顯著差異；美沙拉嗪低劑量組在第2、5、6和7周體質(zhì)量降低顯著改善，在第2、6和7周疾病活動(dòng)評(píng)分顯著改善；美沙拉嗪高劑量組在第1、2、4、5、6和7周體質(zhì)量降低顯著改善，在第2～7周疾病活動(dòng)評(píng)分顯著改善。

圖2 DSS誘導(dǎo)的Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠體質(zhì)量和疾病活動(dòng)指數(shù)變化Fig 2 Body weight and disease activity index changes of DSS-induced Il10-/-；Lgr5-EGFP mice

美沙拉嗪有效抑制Il10-/-；Lgr5-EGFP模型的炎癥因子的表達(dá)和組織病變對(duì)小鼠的血清炎癥因子進(jìn)行ELISA檢測(cè)（圖3），和對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-12/23 p40、IL-17A、TNF-α和IFN-γ等炎癥因子含量顯著增加（P＜0.001）。50和150 mg·kg-1·d-1的美沙拉嗪均可顯著抑制Il10-/-；Lgr5-EGFP模型組血清中各炎癥因子水平（P＜0.001）。150 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪對(duì)血清中IL-12/23 p40和TNF-α的 抑 制效果優(yōu)于50 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪（P＜0.01）。

圖3 DSS誘導(dǎo)的Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠血清炎癥因子Fig 3 Inflammatory cytokines in serum of DSS-induced Il10-/-；Lgr5-EGFP mice

我們通過(guò)RT-qPCR定量檢測(cè)了各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的mRNA表達(dá)水平。和對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中Il12/23 p40、Il17a、Tnf-a和Ifng的mRNA表達(dá)水平顯著上升（P＜0.001），50和150 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪均可顯著抑制模型組各炎癥 因子的mRNA表達(dá)水平，150 mg·kg-1·d-1美沙拉 嗪 對(duì)Il12/23 p40、Tnf-a和IfngmRNA表 達(dá) 的 抑制作用顯著優(yōu)于50 mg·kg-1·day-1美沙拉嗪（圖4）。

圖4 DSS誘導(dǎo)的Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA表達(dá)Fig 4 Colonic inflammatory cytokine mRNA expression of DSS-induced Il10-/-；Lgr5-EGFP mice

病理組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)嚴(yán)重潰瘍、隱窩結(jié)構(gòu)破壞和嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而美沙拉嗪組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，有大量完整隱窩結(jié)構(gòu)保留，表明該模型引起的慢性炎癥對(duì)上皮屏障產(chǎn)生了明顯破壞，且可被陽(yáng)性藥緩解。

這些結(jié)果表明，Il10-/-；Lgr5-EGFP模型小鼠具有明顯的炎癥和上皮屏障損失的表型，且可以被美沙拉嗪顯著抑制。

美沙拉嗪有效挽救Il10-/-；Lgr5-EGFP模型的ISCs丟失對(duì)小鼠結(jié)腸的冰凍切片進(jìn)行DAPI染色，在熒光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察Lgr5-EGFP的表達(dá)情況。對(duì)照組小鼠結(jié)腸隱窩底部存在一定數(shù)量的Lgr5-EGFP陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組小鼠結(jié)腸隱窩底部的Lgr5-EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖5）。美沙拉嗪可以在一定程度上恢復(fù)小鼠結(jié)腸隱窩底部的Lgr5-EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果表明，Il10-/-；Lgr5-EGFP模型表現(xiàn)出類(lèi)似CD患者Lgr5+ISCs丟失的表型，而美沙拉嗪可以修復(fù)ISCs丟失（圖6）。

圖5 DSS誘導(dǎo)的Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠結(jié)腸切片的HE染色圖片F(xiàn)ig 5 HE staining images of colon sections in DSS-induced Il10-/-；Lgr5-EGFP mice

圖6 DSS誘導(dǎo)的Il10-/-；Lgr5-EGFP小鼠結(jié)腸部位Lgr5+ISCs觀(guān)察Fig 6 Observation of Lgr5+ISCs in colon of DSS-induced Il10-/-；Lgr5-EGFP mice

討 論

ISCs在上皮屏障恢復(fù)過(guò)程中扮演著重要角色，被認(rèn)為是炎性腸病潛在治療靶點(diǎn)［10-16］。目前對(duì)于ISCs在IBD中作用的研究采用的是7天DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型。急性DSS結(jié)腸炎更適用于研究上皮破壞后黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)的暫時(shí)性喪失以及初始損傷后黏膜愈合的機(jī)制，但該模型并不能體現(xiàn)人類(lèi)IBD特有的慢性和復(fù)發(fā)性特征，其作為IBD藥物篩選模型的合理性仍存在爭(zhēng)議［19］。因此，我們選擇了和人類(lèi)IBD更為接近的Il10-/-小鼠和干細(xì)胞示蹤的Lgr5-EGFP小鼠雜交，獲得可以通過(guò)綠色熒光蛋白觀(guān)察ISCs數(shù)量的慢性結(jié)腸炎模型小鼠。在SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境中，每只Il10-/-小鼠自發(fā)出現(xiàn)結(jié)腸炎表型的周齡并不相同，這可能會(huì)提升其作為藥物評(píng)價(jià)模型的不可控性。因此，我們對(duì)相同周齡的Il10-/-小鼠采用3% DSS連續(xù)誘導(dǎo)4天，造成小鼠腸黏膜的初始損傷，之后恢復(fù)正常飲水，使小鼠產(chǎn)生持續(xù)的慢性結(jié)腸炎。我們觀(guān)察到在誘導(dǎo)7周后，Il10-/-小鼠出現(xiàn)明顯的Lgr5+ISCs耗竭，這和在人類(lèi)CD中觀(guān)察到的ISCs減少相一致［10］。但是，我們也發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)DSS初始誘導(dǎo)的Il10-/-小鼠會(huì)自發(fā)產(chǎn)生輕度結(jié)腸炎癥狀，并出現(xiàn)明顯的隱窩增生異常。這種上皮細(xì)胞過(guò)度增殖的表現(xiàn)提示，IL-10缺失在上皮屏障未遭到破壞的情況下，可能并不會(huì)造成ISCs耗竭。這種模型上的差異同樣體現(xiàn)在藥物干擾上。有研究報(bào)道，美沙拉嗪對(duì)于DSS誘導(dǎo)的大鼠腸炎模型中的Lgr5+ISCs并沒(méi)有顯著的保護(hù)作用［20］。而在本模型中，美沙拉嗪有效促進(jìn)了Lgr5+ISC的恢復(fù)。推測(cè)原因可能是：DSS模型的作用機(jī)制源于DSS對(duì)上皮細(xì)胞的毒性，進(jìn)而破壞黏膜屏障，導(dǎo)致共生菌的易位，引發(fā)急性炎癥；而本模型盡管使用了DSS作為初始誘導(dǎo)劑，但之后形成的慢性腸炎更接近IL-10缺失導(dǎo)致的免疫缺陷型腸炎，主要由Treg下調(diào)導(dǎo)致的免疫耐受受損引起［21］。有研究指出，美沙拉嗪通過(guò)芳香烴受體增加結(jié)腸中TGF-β1活性形式的水平，從而促進(jìn)CD4+Treg細(xì)胞分化［22］，且TGF-β1已經(jīng)被證明是ISCs自我更新的必要信號(hào)途徑［23］。這樣就解釋了美沙拉嗪在Treg缺失主導(dǎo)Il10-/-小鼠模型表現(xiàn)出更好的ISCs恢復(fù)效果。

綜上所述，我們開(kāi)發(fā)了一種具有炎癥免疫和ISCs雙靶向效應(yīng)評(píng)價(jià)功能的新型炎癥性腸病小鼠模型，并用美沙拉嗪治療證明了該模型的可行性，對(duì)于篩選新型IBD藥物具有重要意義。但本文在對(duì)照組設(shè)置上存在一些缺陷，缺少野生型小鼠的DSS誘導(dǎo)組作為對(duì)照。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，野生型小鼠給予DSS足以誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型，但會(huì)在2周內(nèi)開(kāi)始逐步恢復(fù)至接近正常體質(zhì)量水平，理論上來(lái)說(shuō)，不會(huì)像Il10-/-小鼠給予DSS模型一樣形成慢性炎癥。出于完整的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮，應(yīng)當(dāng)設(shè)置一組野生基因型小鼠給予4天DSS誘導(dǎo)作為完整模型的對(duì)照。

作者貢獻(xiàn)聲明鮑維廉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和執(zhí)行，數(shù)據(jù)收集和分析，論文撰寫(xiě)和修改。尤科淵，馮桂澤，曹心悅實(shí)驗(yàn)執(zhí)行，數(shù)據(jù)收集。沈曉燕論文構(gòu)思和審閱，基金申請(qǐng)，技術(shù)支持。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。