梨幼果FWL1膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA文庫(kù)構(gòu)建及互作蛋白的篩選

賽靜憶，溫玥，郝志超，田嘉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】果實(shí)大小為數(shù)量性狀遺傳，是由細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目共同決定的[1-3]。庫(kù)爾勒香梨（PyrussinkiangensisYu）為薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）梨屬（Pyrus.L）植物，是新疆特色水果之一[4]。庫(kù)爾勒香梨皮薄肉脆、獨(dú)特芳香、耐貯藏等，但果實(shí)偏小，平均單果重僅為100 g 左右，且可食部位較少。不同大小香梨果實(shí)經(jīng)濟(jì)價(jià)值差異較大。Fw2.2（fruit weight2.2）基因是影響果實(shí)大小中最重要的數(shù)量性狀基因之一，在細(xì)胞分裂時(shí)期對(duì)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行負(fù)調(diào)控，占整個(gè)果實(shí)大小變異的30%。但該基因?yàn)槟さ鞍?，不能直接行使其功能。分析研究梨FWL（fruit weight2.2-like）同源基因與其互作蛋白之間的關(guān)系，構(gòu)建梨幼果FWL1 膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA 文庫(kù)，對(duì)研究FWL1基因調(diào)節(jié)果實(shí)大小機(jī)理有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與果實(shí)大小性狀關(guān)聯(lián)的基因，以不同方式影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控果實(shí)大小。目前，從番茄中分離的fw2.2 是目前已知調(diào)節(jié)果實(shí)大小最關(guān)鍵的基因。細(xì)胞分裂時(shí)期，在小果野生種表達(dá)量較高，在大果栽培品種中表達(dá)量較低，影響細(xì)胞數(shù)目，負(fù)調(diào)控果實(shí)大小，占整個(gè)果實(shí)大小變異的30%。fw2.2為細(xì)胞膜蛋白，不能直接行使其功能，通過(guò)酵母雙雜交表明，與酪蛋白激酶II（CKII）調(diào)節(jié)亞基的同源蛋白相互作用[5]，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，進(jìn)一步影響果實(shí)質(zhì)量與體積[6]。李志超等[7]從酸漿屬中分離了fw2.2 的同源基因，命名為Physalis Organ Size2（POS2），POS2不但影響果實(shí)大小，對(duì)其他組織和器官大小也具有負(fù)調(diào)控作用。POS2 同樣為細(xì)胞膜蛋白，與PhysalisfloridanCKⅡβ1（PfCKⅡβ1）和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子PfAGAMOUS-like（PfAG2）等蛋白發(fā)生互作，而PfAG2 能抑制PhysalisfloridancyclinD2；1（PfCyclinD2；1）的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞分裂起到調(diào)控作用[7]。除了番茄與酸漿屬，fw2.2 同源基因在水稻、玉米、鱷梨、大豆等物種中相繼被分離出[8-11]，且皆具備調(diào)控細(xì)胞分裂、控制果實(shí)大小的作用。酵母雙雜交技術(shù)是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的技術(shù)方法，目前已被應(yīng)用在多個(gè)物種上。雷海英等[12]研究玉米中心蛋白（Zea maysL.centrin，ZmCEN）的生物學(xué)功能構(gòu)建了玉米的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，篩出28個(gè)和ZmCEN有互作關(guān)系的蛋白質(zhì)。王洋等[13]構(gòu)建了番茄cDNA 酵母雙雜交文庫(kù)，篩選出了6個(gè)與Pti4 互作的轉(zhuǎn)錄因子。鄭巧玲等[14]構(gòu)建了山葡萄低溫誘導(dǎo)酵母雙雜三框cDNA 文庫(kù)，篩選出VaPYL9 與VaCIPK18 有互作關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期從梨中分離出梨3個(gè)fw2.2 同源基因FWL[15-16]，但其調(diào)控梨果實(shí)大小機(jī)理尚不明確。需研究梨FWL1基因與其互作蛋白作用機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以杜梨、庫(kù)爾勒香梨、鴨梨、早美香果實(shí)細(xì)胞分裂關(guān)鍵時(shí)期果肉組織為材料，構(gòu)建梨幼果FWL1 膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA 文庫(kù)，篩選出與梨FWL1 互作的蛋白，為梨FWL1基因調(diào)節(jié)果實(shí)大小機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 梨

杜梨、庫(kù)爾勒香梨、鴨梨、早美香由新疆庫(kù)爾勒市香梨研究中心科研實(shí)驗(yàn)基地采摘。每個(gè)品種分別選取一棵樹勢(shì)適中、生長(zhǎng)狀況良好、管理水平一致的10年生樹，在果肉細(xì)胞分裂關(guān)鍵時(shí)期（授粉后15 d），每個(gè)品種分別采摘30個(gè)果實(shí)，去皮將果肉部分切下后立即置于液氮中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Oligotex mRNA Kits（Qiagen，德國(guó)）、DEPC 水（Beyotime，中國(guó)）、無(wú)水乙醇（國(guó)藥，中國(guó)）、Normal-RunTMprestained 250 bp-I DNA ladder（上海捷瑞，中國(guó)）、NormalRunTMprestained 250 bp-II DNA ladder（上海捷瑞，中國(guó)）、Supscript double stand cDNA Kit（invitrogen，美國(guó)）、Trimmer-2 cDNA normalization Kit（Evrogen，俄 羅 斯）、μltraPureTM Phenol：Chloroform Isoamyl：Alcohol（25：24：1，v/v）（sigma，美國(guó)）、pBT3-SUC（DUALsystemsBioTech，瑞士）、pBT3-STE（DUALsystemsBioTech，瑞士）、真核表達(dá)菌株NMY51（DUALsystemsBioTech，瑞士）、YPDA（陜西普因特，中國(guó)）、SD/-Leu with Agar（陜西普因特，中國(guó)）、SD/-Leu/-Trp with Agar（陜西普因特，中國(guó)）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（陜西普因特，中國(guó)）、釀酒酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化試劑盒（陜西普因特，中國(guó)）、3AT（Sigma，美國(guó)）、X-a-gal（Goldbio，美國(guó)）、Cycle-Pure Kit（OMEGA，中國(guó)）、TransStartFastPfu DNA Polymerase（全式金，中國(guó)）、Quick-Cloning MIX（陜西普因特，中國(guó)）、TransFastTaq DNA Polymerase（全式金，中國(guó)）。

1.1.3主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（eppendorf，德國(guó)）、移液器（eppendorf，德國(guó)）、各型號(hào)離心管（Axygen，美國(guó)）、PCR儀（東勝，中國(guó)）、電轉(zhuǎn)化儀（eppendorf，德國(guó)）、精密生化培養(yǎng)箱（上海精宏，中國(guó)）、恒溫?fù)u床（上海知楚，中國(guó)）、高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

將杜梨、庫(kù)爾勒香梨、鴨梨、早美香的幼果果肉組織放入帶有液氮的研缽中，充分研磨至粉末狀。選擇Trizol 法對(duì)細(xì)胞的總RNA 進(jìn)行提取，將洗脫下的RNA 取5μL 用于瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，其余放置在-80℃貯存。經(jīng)NanoDrop 2 000核酸分析儀對(duì)總RNA的質(zhì)量及其濃度鑒定。

1.2.2 mRNA分離

參照Oligotex mRNA Kits 說(shuō)明書對(duì)mRNA 進(jìn)行分離。

1.2.3 cDNA合成

在預(yù)冷的0.5 mL 無(wú)菌離心管中加入2μL mRNA 樣品、1μL 的SMART ⅣOligonucleotide 及1μL 的CDS-3M PCR Primer，將其混勻后放入離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心，將混合物于管底聚集，之后72℃，2 min，接著置冰上2 min，再次瞬時(shí)離心，讓其均聚集于管底，向每一個(gè)管中加入2 μL 的5×First-Strand Buffer、1μL 的DDT（20 mM）、1μL 的dNTP Mix（10 mM）、1 μL 的PowerScriptTMReverse Transcriptase，輕輕吹吸使其充分混合，瞬時(shí)離心，42℃保育1 h，將離心管擱至在冰上，合成cDNA第一鏈。取一個(gè)新的離心管（0.5 mL）預(yù)冷，轉(zhuǎn)入2μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將其擱至冰上，準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)步驟。

采用LD PCR對(duì)cDNA擴(kuò)增，獲得雙鏈cDNA，將PCR 儀預(yù)熱至95℃。在0.5 mL 反應(yīng)管中加入以下試劑。表1

表1 二鏈合成cDNA所需試劑Table 1 Reagents required for two strand cDNA synthesis

輕彈離心管，瞬時(shí)離心，將管內(nèi)物質(zhì)集中在離心管的底部，滴入2 滴礦物油，覆蓋管內(nèi)物質(zhì)，PCR 95℃預(yù)熱后擴(kuò)增，擴(kuò)增步驟為95℃1 min，95℃10 s，68℃6 min（每過(guò)1個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間增加5 s），20個(gè)循環(huán)，68℃5 min，16℃10 min。取5μL的產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。

1.2.4 均一化處理

1.2.4.1 二鏈PCR產(chǎn)物純化

使用QIAquick PCR Purification Kit 對(duì)二鏈PCR 產(chǎn)物純化。按照5：1 的體積比例將PBI 溶液加入到PCR反應(yīng)物內(nèi)，將體系混合后加入吸附柱的膜上，10 000 r/min，1 min，棄濾液，加入0.75 mL PE Buffer 于膜上，10 000 r/min，離心1 min，取一個(gè)新的收集管，加入12μL純化水于膜上。

1.2.4.2 雜交

在0.2 mL 無(wú)菌離心管中加入12μL SMARTprepared ds cDNA（1 200 ng of dissolved cDNA）、4μL 4×Hybridization buffer，混勻后瞬時(shí)離心，將其平均分為4 份，各滴入2 滴礦物油，13 000 r/min，室溫離心2 min，于98 ℃下溫浴2 min，之后在68 ℃下溫浴5 h。

1.2.4.3 DSN處理

將1/2 倍（1 μL DSN storage buffer 與1 μL DSN混勻）置于冰上，68℃預(yù)熱DSN master buffer，在每個(gè)PCR 管中加入5 μL 預(yù)熱的DSN master buffer，混合至均勻，瞬時(shí)離心，之后迅速置于68℃，保溫10 min。在管1（DSN1）中加入1 μL DSN 酶液，管2（DSN1/2）中加入1 μL 1/2DSN 酶液，管4（Control）中加入1 μL DSN storage buffer，管3（DSN1/4）不添加試劑，將其分別置于68℃保溫25 min，加入10μL stop solution于每個(gè)管中，充分混合后瞬間離心，68℃下保溫5 min，將PCR 管置于冰上并添入20μL純化水行充分混合。

1.2.4.4 第1次PCR擴(kuò)增經(jīng)DSN處理的樣品

對(duì)每個(gè)樣品，在無(wú)菌的PCR 管內(nèi)加入第1 次擴(kuò)增的試劑。

將管內(nèi)混合物混勻后瞬間離心。開始第1次PCR擴(kuò)增，步驟為95℃1 min，95℃15 s，68℃6 min（每過(guò)1個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間增加5 s），7個(gè)循環(huán)，68℃5 min。經(jīng)對(duì)照以判斷PCR的最適循環(huán)數(shù)，將剩余的樣品擱于冰上保存。表2

表2 PCR擴(kuò)增所需試劑Table 2 Reagents required for PCR amplification

1.2.4.5 第2次PCR擴(kuò)增經(jīng)DSN處理的樣品

加入20μL純化水于1倍酶處理的2μL PCR樣品中，混合均勻后加入第2 次擴(kuò)增的試劑，混勻，PCR 程序：95℃1 min，12個(gè)循環(huán)，95℃15s，66℃20s，72℃3min，接著64℃15s，72℃3min，取5μL電泳測(cè)定。

1.2.5 PCR產(chǎn)物純化及二鏈回收

用QIAquick PCR Purification Kit 進(jìn)行純化，加41μL無(wú)菌水至膜上溶解，離心，測(cè)定濃度。二鏈回收用1×TAE 配置1%瓊脂糖膠，點(diǎn)上Marker，隔一個(gè)以上泳道點(diǎn)樣品，70 V 電壓2 h，將Marker切下用含EB的電泳液染色15 ～20 min，用牙簽標(biāo)上1K、3K 的位置，對(duì)照樣品切下1 ～3K 的區(qū)域，稱取膠的重量。用QIAquick Gel Purification Kit純化，按照膠100 mg約等于100μL計(jì)算。加進(jìn)3倍體積的QG buffer，至50℃水浴10 min，直到膠全部融解，每2 min 進(jìn)行顛倒混合均勻1 次，將化開膠液加至柱子，10 000 r/min 離心1 min，棄過(guò)濾物，在柱子膜上加750μL PE buffer，10 000 r/min，離心1 min，棄過(guò)濾物，12 000 r/min 甩干1 min，在膜上加15μL無(wú)菌水，12 000 r/min，1 min，保留濾下液體，確認(rèn)其濃度。

1.2.6 cDNA與載體的連接

利用同源重組的方法，將3μL酶切后的線性化三框載體pPR3-N（雙雜交）與上步中7 μL 的cDNA混合，取5μLInfusion重組酶、5μL水，將其充分融合后放入50 ℃中1 h，取2μL 蛋白酶K 對(duì)重組酶滅活，再加入78μL無(wú)菌水，將總體積加至100μL，之后依次加入1μL Glycogen（20μg/μL）、50μL 7.5 M NH4OAC、375μL 100%ethanol，充分混合，將其放在-80℃中至少1 h，在4℃下16 000 r/min 離心30 min，棄上清，加入150 μL70%的乙醇，在4℃下，16 000 r/min，離心3 min。再次重復(fù)這個(gè)過(guò)程，棄上清，保持cDNA沉淀，置室溫下5 ～10 min 晾干cDNA，取10 μLDEPC 水重懸cDNA，用槍對(duì)其進(jìn)行30 ～40 次吹吸，瞬時(shí)離心2 s 后對(duì)cDNA進(jìn)行收取，即刻放置于冰上。

1.2.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

在-80℃下放入1 mm 電擊杯（Bio-Rad）進(jìn)行30 min 的預(yù)冷處理，將感受態(tài)細(xì)胞50μL 及重組產(chǎn)物2.5 μL 在電擊杯放在冰上的前提下一同放入杯內(nèi)，持續(xù)放置45 min，經(jīng)電轉(zhuǎn)化儀（Bio-Rad）電擊后，立即加入1 mL LB 培養(yǎng)基，將4次轉(zhuǎn)化后的菌液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的15 mL 離心管內(nèi)，并加入培養(yǎng)基至5 mL，于37℃，225 ～250 r/min 培養(yǎng)1 h以上，之后把培養(yǎng)物稀釋10、100、1 000、10 000倍，將不同倍數(shù)的稀釋液分別涂10μL于平板上，其余置4℃過(guò)夜，也可倒上甘油使?jié)舛戎?0%，于-80℃保存。

1.2.8 酵母雙雜交文庫(kù)質(zhì)量及滴度檢測(cè)

稀釋經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的10μL原液至1 000倍，將其中100μL 涂在LB 平板上（具有氨芐抗性），次日統(tǒng)計(jì)算出文庫(kù)的庫(kù)容量（CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/100μL×1 000 倍×1×103μL、文庫(kù)總CFU=CFU/mL×文庫(kù)菌液總體積mL）。擴(kuò)增挑取的單克隆，用電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物大小檢測(cè)以鑒定插入片段的大小。稀釋原核文庫(kù)菌液10μL至106倍，將其中的100μL 涂在LB 平板上（含A+抗性平板），37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日統(tǒng)計(jì)，文庫(kù)滴度CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/100μL/10μL×106倍×1 000μL。

1.2.9 誘餌載體構(gòu)建

利用前期克隆的梨果實(shí)大小相關(guān)基因FWL1（Genebank 收錄號(hào)為：KM249876）[15]，根據(jù)pBT3-N、pBT3-C、pBT3-SUC、pBT3-STE 四個(gè)載體分別設(shè)計(jì)梨FWL1 基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物，并以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程為：95℃5 min，95℃30 s、56℃30 s、72℃2 min（該過(guò)程30個(gè)循環(huán)），72 ℃10 min。之后對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收。對(duì)pBT3-N/C/SUC/STE 載體進(jìn)行酶切，按照線性化載體（pBT3-N/C/SUC/STE）50 ng、對(duì)應(yīng)FWL1 cDNA50 ng、Quick-Cloning MIX2 5μL，補(bǔ)水至10μL 配置反應(yīng)體系，用DNA 連接酶將PCR 產(chǎn)物與線性化pBT3-N/C/SUC/STE載體連接，55℃，20 min，30℃，30 min，取1.5 mL EP 管置于冰上，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，再加入2μL 連接產(chǎn)物，用手指輕輕彈EP 管2 次，置于冰上30 min，42℃熱擊90 s，迅速置于冰上5 min，加1 mL LB 液體培養(yǎng)基，37℃，150 r/min，震蕩45 min，6 000 r/min 離心5 min，去上清，留100μL上清液吹打沉淀使之混勻，涂布對(duì)應(yīng)抗性平板，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)后挑取白色單克隆菌落搖菌，菌液PCR，各挑取陽(yáng)性克隆斑至加有相應(yīng)抗性5 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，220 r/min培養(yǎng)12 h，小提質(zhì)粒，用對(duì)應(yīng)引物測(cè)序。表3

表3 PCR引物Table 3 List of PCR primers

1.2.10 誘餌表達(dá)載體自激活及功能測(cè)定

參考釀酒酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化試劑盒（貨號(hào)PT1183）對(duì)NMY51 酵母進(jìn)行感受態(tài)制備。將Carrier DNA 和pTSU2-APP 及pNubG-Fe65 混合，加入NMY51感受態(tài)和PEG/LiAc轉(zhuǎn)化液，制備好后重懸，各取100 μL 分別涂布DDO/X（SD/-Leu/-Trp/X-a-gal）、QDO/X 平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal）平板，倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d。對(duì)宿主（pTSU2-APP和pNubG-Fe65）檢測(cè)。

將構(gòu)建好pBT3-N/C/SUC/STE-FWL1 四個(gè)載體分別與pOst1-NubI、pPR3-N 混合，分別加入Carrier DNA（10μg/mL），分成8組，加入NMY51感受態(tài)50μL和PEG/LiAc 轉(zhuǎn)化液500μL，制備好后重懸，1 ～4 組各取100 μL 分別涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）及QDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Xa-Gal）平板，5 ～6 組取100 μL 涂布SD/-Leu 平板，并倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，對(duì)其進(jìn)行功能檢測(cè)和自激活檢測(cè)。

取1支EP管，加入500μL 0.9%NaCl溶液，從上述轉(zhuǎn)化NMY51[pBT3-N-FWL1&pPR3-N]平板挑取1 株?duì)顟B(tài)較好菌落挑入EP 管中，混勻，均稀釋OD值為0.1和0.01，并分別取2μL菌液分別點(diǎn)加在DDO、QDO/10mM3-AT、QDO/20mM3-AT、QDO/30mM3-AT、QDO/40mM3-AT、QDO/50mM3-AT平板上，30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，觀察生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.11 互作蛋白的篩選

挑取NMY51（pBT3-N-FWL1）單菌落（直徑2 ～3 mm）于YPD Plus 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；用TE/Li-Ac 感受態(tài)制備液重懸。在CarrierDNA 加入文庫(kù)質(zhì)粒，加入NMY51 感受態(tài)及PEG/LiAc 轉(zhuǎn)化液進(jìn)行培養(yǎng)，最后用NaCl 重懸，各取10 μL 轉(zhuǎn)化液稀釋10 000 倍取100 μL 分別涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）平板上，并倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率。將剩余轉(zhuǎn)化液全部涂布于80個(gè)QDO/50mM3-AT（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/50mM3-AT）平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性克隆子。將篩選所得陽(yáng)性克隆子分別轉(zhuǎn)接于100μL 0.9%NaCl溶液中，測(cè)OD600值，通過(guò)補(bǔ)加適量0.9%NaCl 溶液使OD600 值為1，各取1μL菌液接種于QDO/50mM3-AT平板上，30℃培養(yǎng)3 ～5 d，對(duì)陽(yáng)性克隆統(tǒng)計(jì)。挑單斑接種裝有2 000μLSD/-Leu/-Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，220 r/min，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取酵母質(zhì)粒，將PCR 產(chǎn)物送測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果肉組織總RNA提取

研究表明，28 S 與18 S 條帶明晰，RNA 沒有污染，較為完整?？俁NA 經(jīng)NanoDrop 2 000 測(cè)定后得出RIN≥7，A260/A280為2.01～2.08，其濃度及質(zhì)量均達(dá)到要求。圖1

圖1 梨肉組織總RNA電泳Fig.1 Total RNA from pear fruit tissues separated on agarose gel

2.2 ds cDNA合成與鑒定

研究表明，ds cDNA 片段集中分布于250 ～2 000 bp，呈彌散狀，包含不同大小和豐度差異的mRNA取得有效反轉(zhuǎn)錄，符合建庫(kù)基本要求。圖2

圖2 LD-PCR 電泳Fig.2 LD-PCR amplification products by agarose gel electrophoresis

2.3 均一化ds cDNA鑒定結(jié)果

研究表明，經(jīng)均一化處理過(guò)的ds cDNA 無(wú)特異性條帶的出現(xiàn)，其覆蓋片段長(zhǎng)度范圍與未均一化處理的ds cDNA 一致，且出現(xiàn)亮度較為統(tǒng)一的彌散狀條帶，不同片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拷貝數(shù)已被調(diào)節(jié)至相似數(shù)目。圖3

圖3 均一化ds cDNA電泳Fig.3 Normalized ds cDNA by agarose gel electrophoresis

2.4 文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

研究表明，庫(kù)容為3×107CFU，大于1×107CFU，該文庫(kù)的庫(kù)容量較高。平均插入片段大于1 000 bp，陽(yáng)性率≥98%，該文庫(kù)的重組率和隨機(jī)性符合要求。平板上菌落數(shù)量大于600個(gè)，該文庫(kù)滴度為≥6×108CFU/mL，文庫(kù)的各類指標(biāo)符合基本要求。圖4

圖4 均長(zhǎng)檢測(cè)Fig.4 Average length detection

2.5 誘餌表達(dá)載體自激活及功能檢測(cè)

2.5.1 宿主檢測(cè)

研究表明，無(wú)論在DDO/X 或QDO/X 平板上，均能生長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，宿主基因型狀態(tài)未發(fā)生突變，各報(bào)告基因能正常激活。圖5

圖5 宿主驗(yàn)證Fig.5 Host validation

2.5.2 功能檢測(cè)和自激活檢測(cè)

研究表明，共轉(zhuǎn)組pBT3-N-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-N-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生長(zhǎng)，在QDO/X 平板上能正常生長(zhǎng)且變藍(lán)；共 轉(zhuǎn) 組pBT3-C-FWL1 及pOst1-NubI 和pBT3-C-FWL1 及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生長(zhǎng)，在QDO/X 平板上未能生長(zhǎng)；共轉(zhuǎn)組pBT3-SUC-FWL1及pOst1-NubI和pBT3-SUC-FWL1及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生長(zhǎng)，在QDO/X 平上未能生長(zhǎng)；共轉(zhuǎn)組pBT3-STE-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-STE-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生長(zhǎng)，在QDO/X平板上只有少量菌斑變藍(lán)。pBT3-N一個(gè)載體可用。圖6

圖6 誘餌表達(dá)載體功能和自激活檢測(cè)Fig.6 Decoy expression vector function and self-activation detection

2.5.3 3-AT工作濃度檢測(cè)

研究表明，NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）在QDO/50mM3-AT 平板上生長(zhǎng)受到抑制。圖7

圖7 NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）

2.6 文庫(kù)篩選

研究表明，每次篩選菌斑數(shù)＞1 000，轉(zhuǎn)化率≥1.0×106CFU，共轉(zhuǎn)效率達(dá)到篩庫(kù)要求。圖8

圖8 篩庫(kù)轉(zhuǎn)化效率Fig.8 Screen storage conversion efficiency

2.7 酵母陽(yáng)性克隆DNA提取和測(cè)序比對(duì)

研究表明，與梨FWL1 篩選互作蛋白長(zhǎng)出了300個(gè)以上菌斑，在陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)接測(cè)序中，共計(jì)長(zhǎng)出274個(gè)陽(yáng)性克隆，共計(jì)272個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序成功，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)。有13個(gè)未知蛋白，6個(gè)蛋白出現(xiàn)頻率在10次以上，其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的預(yù)測(cè)功能顯示與細(xì)胞分裂有關(guān)。表4

表4 出現(xiàn)10次以上的梨FWL1互作蛋白及其功能預(yù)測(cè)Table 4 FWL1 interacting proteins of pear with more than 10 occurrences and their functional prediction

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)多用來(lái)研究蛋白互作及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[17]，也是迄今為止研究蛋白質(zhì)互作中最常用的生物技術(shù)之一[18]。傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)適用于定位在細(xì)胞核內(nèi)的互作蛋白。試驗(yàn)研究的FWL1 基因定位于細(xì)胞膜，不能直接行使功能，而DUAL membrane 技術(shù)在原有酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用分離的泛素系統(tǒng)（splitubiquitin）進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的篩選，為膜蛋白互作研究提供了可能[19]。酵母雙雜交三框cDNA文庫(kù)通過(guò)在普通單獨(dú)文庫(kù)上逐個(gè)增添了一個(gè)堿基于上游引物上，使得其讀碼框后移一到兩位，用可能的3種讀碼框來(lái)表達(dá)克隆的cDNA，能夠更好的捕捉生物體內(nèi)真實(shí)的讀碼方式，確保篩選出所有可以正確表達(dá)的插入片段，提升了文庫(kù)表達(dá)效率[20]。由于DSN 要求cDNA 片段長(zhǎng)度和未經(jīng)均一化處理的覆蓋范圍必須一致，能在不損壞大片段cDNA 的前提下，有效去除高豐度的cDNA[21]，增加文庫(kù)內(nèi)cDNA均一化程度。實(shí)驗(yàn)利用同源重組的手段連接了合成的cDNA及通過(guò)酶切處理后的pPR3-N 載體。基因組DNA 多個(gè)序列與線性化DNA兩端具備同源性，這將大大提升后續(xù)重組連接的精確性。這種方法結(jié)合了其它連接方法的優(yōu)點(diǎn)，降低了操作難度，提升了連接的效率，提升文庫(kù)的質(zhì)量[22]。

判斷cDNA文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)是文庫(kù)的庫(kù)容和重組cDNA 序列的完整性[23]。文庫(kù)當(dāng)中的獨(dú)立重組子克隆數(shù)就是該文庫(kù)的庫(kù)容量，獨(dú)立重組子克隆數(shù)的數(shù)量代表了該文庫(kù)的覆蓋度。cDNA文庫(kù)最少應(yīng)當(dāng)含有1×106CFU 的庫(kù)容量[24]，經(jīng)檢測(cè)，研究所構(gòu)建的梨幼果膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA 文庫(kù)的庫(kù)容量為3×107CFU，大于1×106CFU。構(gòu)建的炭疽菌侵染后刺葡萄果皮酵母雙雜交cDNA文庫(kù)、陸地棉酵母雙雜交cDNA文庫(kù)以及小麥酵母雙雜交cDNA 文庫(kù)的庫(kù)容量均大于1×106CFU[25-27]。研究所構(gòu)建的梨幼果膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA文庫(kù)符合建庫(kù)的基本要求。重組cDNA序列完整性由重組率與插入片段的長(zhǎng)度共同組成[21]。構(gòu)建的草莓果實(shí)酵母雙雜交文庫(kù)、劍麻酵母雙雜交cDNA 表達(dá)文庫(kù)以及Cf-19 介導(dǎo)的抗番茄葉霉病免疫應(yīng)答酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的平均插入片段長(zhǎng)度均大于500 bp，且陽(yáng)性重組率為92%以上[28-30]。研究構(gòu)建的cDNA文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)，

平均插入片段大于1 000 bp，陽(yáng)性重組率≥98%。文庫(kù)指標(biāo)合格，符合后續(xù)篩庫(kù)的基本要求。

篩選的272個(gè)互作的候選蛋白中，collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的預(yù)測(cè)功能可能與梨果實(shí)細(xì)胞分裂有關(guān)。collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 為膠原蛋白和含鈣結(jié)合EGF域的蛋白，EGF為表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor EGF）[31-32]，EGF 可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化[33-34]，龐實(shí)鋒等[35]將大豆油體和EGF 融合基因成功轉(zhuǎn)化進(jìn)紅花細(xì)胞的基因組中，并證實(shí)表達(dá)的EGF 對(duì)一些細(xì)胞具有促細(xì)胞增殖活 性。 metallothionein- like protein type 2 和metallothionein-like protein（Met1）為金屬硫蛋白（metallothionein，MT），其功能為螯合重金屬離子及重金屬解毒，參與必須微量元素的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝，參與激素和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)等[36]。Yuan等[37-38]研究發(fā)現(xiàn)水稻OsMT2b 參與了植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素的調(diào)控，MT 可能在細(xì)胞的修復(fù)、生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起著金屬調(diào)節(jié)劑的作用[39]。梨FWL1可能與上述兩個(gè)蛋白互作后調(diào)節(jié)梨果實(shí)大小。

4 結(jié)論

利用DUAL membrane 系統(tǒng)構(gòu)建梨幼果膜系統(tǒng)酵母雙雜交三框cDNA 文庫(kù)，文庫(kù)的庫(kù)容量為3×107CFU，平均插入片段大于1 000 bp，陽(yáng)性率≥98%，均達(dá)到cDNA 文庫(kù)的建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，符合后續(xù)篩庫(kù)的基本要求。誘餌載體無(wú)自激活功能，利用共轉(zhuǎn)化方法，篩選出272個(gè)與FWL1互作的蛋白質(zhì)，其中collagen and calcium-binding EGF domaincontaining protein 1 和metallothionein-like protein可能與梨果實(shí)大小發(fā)育有關(guān)。