微生物腐蝕研究中代謝組學(xué)方法的應(yīng)用進(jìn)展

付強(qiáng)，許萍

(北京建筑大學(xué) 水環(huán)境國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 城市雨水系統(tǒng)與水環(huán)境省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044)

腐蝕經(jīng)常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在2014年，我國(guó)的腐蝕成本約為21 278.2 億元人民幣，約占當(dāng)年國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值的 3.34%[1]。在石油和天然氣工業(yè)、冷卻水系統(tǒng)、污水管道系統(tǒng)、飲用水系統(tǒng)和海洋工業(yè)中都經(jīng)常出現(xiàn)微生物腐蝕的現(xiàn)象。其中微生物腐蝕涉及到微生物、腐蝕金屬和周?chē)h(huán)境等多個(gè)方面[2]，因此，需要研究微生物腐蝕所涉及的三個(gè)方面[3]，才能理解微生物腐蝕背后的機(jī)制并制定有效防腐蝕對(duì)策[4]，目前環(huán)境因素和腐蝕金屬方面的研究已經(jīng)相對(duì)充分[5-6]，但是關(guān)于腐蝕點(diǎn)位的微生物群落形成機(jī)制和導(dǎo)致微生物腐蝕發(fā)生的分子的信息尚少。

目前對(duì)微生物腐蝕中微生物群落的研究已經(jīng)從對(duì)微生物計(jì)數(shù)的宏觀測(cè)定發(fā)展到對(duì)微生物群落中存在的DNA的分子分析，再發(fā)展到大規(guī)模測(cè)序以確定微生物群落微生物種類(lèi)[7]。表征微生物腐蝕中的微生物群落組成已被證明是有助于研究群落中不同生物體的具體功能的[8]。通過(guò)基于代謝組學(xué)的技術(shù)探索微生物腐蝕，可以進(jìn)一步了解腐蝕中微生物種群的多樣性及其代謝機(jī)理。

1 代謝組學(xué)研究流程與應(yīng)用方法

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，代謝組就是細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的所有低分子量(<1 500 Da)代謝物的整體集合，是生物合成/分解代謝途徑的中間體或產(chǎn)物，并提供細(xì)胞活動(dòng)和生理狀態(tài)的直接功能讀數(shù)[9]。而代謝組學(xué)就是針對(duì)生物代謝組進(jìn)行的全面研究，其重點(diǎn)在于通過(guò)分析確定生物體內(nèi)各種代謝物質(zhì)的形成、分配過(guò)程和時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，結(jié)合統(tǒng)計(jì)生物學(xué)的大數(shù)據(jù)分析與計(jì)算機(jī)模型，在機(jī)理上探明生物代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)規(guī)律，以達(dá)到定量預(yù)測(cè)基因變化與環(huán)境條件改變而導(dǎo)致的生物代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。代謝組學(xué)研究的典型工作流程見(jiàn)圖1。

圖1 組學(xué)研究流程圖Fig.1 Flow chart of metabolomics research

1.1 樣品采集與制備

微生物代謝組學(xué)的樣品制備步驟包括快速取樣、淬滅以及代謝物的提取[10]。樣品制備是為了盡可能地去除樣本中的雜質(zhì)，同時(shí)盡可能的保留樣品中的所需的目標(biāo)代謝產(chǎn)物的完整性。而所需的樣品提取和預(yù)處理方法會(huì)根據(jù)研究對(duì)象、目的和采用的分析技術(shù)不同而不同[11]。

細(xì)胞新陳代謝的變化速率極快，因此，樣品必須快速淬滅以終止代謝反應(yīng)，并且不引起代謝物的任何化學(xué)變化或從細(xì)胞內(nèi)泄漏代謝物。理想的淬滅過(guò)程可以完美地將細(xì)胞凍結(jié)，完全停止所有酶的活動(dòng)，以獲取其“代謝快照”，但是這在處理微生物樣品時(shí)是一項(xiàng)極其困難的任務(wù)[12]。液氮淬滅、酸堿淬滅和低溫甲醇淬滅等是常用的細(xì)胞淬滅方法，低溫甲醇淬滅是目前微生物代謝組學(xué)中常用方法。

在代謝物的提取過(guò)程中應(yīng)去除較大的“污染”分子，如DNA、蛋白質(zhì)，最后去除提取過(guò)程中使用的溶劑。代謝物提取通常包括添加有機(jī)溶劑、裂解細(xì)胞、分離代謝物、蒸發(fā)溶劑，最后留下干燥樣品并冷凍儲(chǔ)存以待使用。之后再根據(jù)不同的檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理方式。

1.2 代謝產(chǎn)物分析與檢測(cè)

由于代謝產(chǎn)物的組分和數(shù)量不同，且代謝產(chǎn)物的官能團(tuán)、揮發(fā)性、極性等存在差異，使用單一分析平臺(tái)往往不能全面地進(jìn)行代謝組學(xué)分析，而且各種分析平臺(tái)都有其適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，因此現(xiàn)在廣泛使用多種分析平臺(tái)組合的方法。表1比較了幾種代謝組學(xué)常用的分析平臺(tái)的特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)[13]。

表1 代謝組學(xué)常用的分析平臺(tái)比較Table 1 Comparison of analysis platforms commonly used in metabolomics

在代謝組學(xué)研究技術(shù)中核磁共振(NMR)是應(yīng)用最早、最為常見(jiàn)的技術(shù)之一。目前常用的有氫譜、碳譜和磷譜，其中以氫譜應(yīng)用得最為廣泛[14]。NMR 技術(shù)對(duì)樣品的需求量相對(duì)較少、幾乎不需要進(jìn)行前處理，能快速準(zhǔn)確地對(duì)樣品進(jìn)行高通量分析，且具有高重現(xiàn)性和無(wú)損傷性，能夠提供一定條件下生物組織或體液的完整代謝產(chǎn)物信息[15]，能用于活體和原位研究[16]。

質(zhì)譜(MS) 是通過(guò)測(cè)定質(zhì)荷比和氣相離子的豐度鑒定樣品中存在的化學(xué)成分的含量和類(lèi)型。MS儀器一般由樣品導(dǎo)入系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。其中，離子源使樣品中各組分發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用形成離子束[17]。質(zhì)量分析器位于離子源和檢測(cè)器之間，是質(zhì)譜儀的核心組成部件，在質(zhì)量分析器中利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將氣相離子在空間或時(shí)間上按照質(zhì)荷比的大小進(jìn)行分離。常見(jiàn)的質(zhì)量分析器有：飛行時(shí)間質(zhì)量分析器、四極桿質(zhì)量分析器、四極桿離子阱和離子回旋共振質(zhì)量分析器等[18]。四級(jí)桿分析器體積小、重量輕、掃描速度快，常與其他質(zhì)譜連接，是目前最成熟、應(yīng)用最廣泛的一種質(zhì)量分析器，但它的質(zhì)量范圍和分辨率有限[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

首先對(duì)原始代謝數(shù)據(jù)需要進(jìn)行預(yù)處理，使其轉(zhuǎn)化成可直接用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的形式。預(yù)處理之后再進(jìn)行PCA和偏最小二乘法判別分析等多元統(tǒng)計(jì)分析和生物信息學(xué)分析，識(shí)別出生物標(biāo)志物、推斷代謝途徑等[20]。表2給出了一些微生物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，有助于識(shí)別生物標(biāo)志物。

表2 微生物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Table 2 Microbial metabolomics database

1.4 典型應(yīng)用方法

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中應(yīng)用代謝組學(xué)研究微生物腐蝕時(shí)，典型的實(shí)驗(yàn)方法是，將金屬試樣浸泡在引起微生物腐蝕的微生物培養(yǎng)物中或是采集的發(fā)生微生物腐蝕的現(xiàn)場(chǎng)水中[21]，該實(shí)驗(yàn)方法將有助于確定培養(yǎng)物或現(xiàn)場(chǎng)水在腐蝕金屬時(shí)發(fā)生的具體反應(yīng)。首先要考慮的是是否要對(duì)代謝物進(jìn)行有針對(duì)性的量化或者是代謝物的廣泛無(wú)偏差的分析。而且應(yīng)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)測(cè)定培養(yǎng)物或現(xiàn)場(chǎng)水中的代謝物，以生成現(xiàn)有化合物的基線輪廓，該基線輪廓再與微生物腐蝕發(fā)生后的化合物輪廓進(jìn)行對(duì)比，從而確定出發(fā)生變化的化合物。并使用化學(xué)成分相同但微生物已滅活的現(xiàn)場(chǎng)水或不含微生物的無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以區(qū)分出微生物群落因非生物腐蝕而產(chǎn)生的代謝物。

在分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采集樣品時(shí)應(yīng)與基線輪廓和對(duì)照組進(jìn)行比較，以確定其代謝物水平與微生物群落相關(guān)。例如，在實(shí)際樣品中檢測(cè)到代謝物但未出現(xiàn)在基線中，這表明代謝物是由于腐蝕而產(chǎn)生的，而與對(duì)照組的比較可以確認(rèn)化合物的來(lái)源是生物的或是非生物的。類(lèi)似的方法可用于分析在基線中存在但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中增加或減少的化合物。

另一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮因素是將縱向分析(即可用于在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的平行實(shí)驗(yàn))納入微生物腐蝕研究中，以便識(shí)別對(duì)微生物腐蝕的發(fā)生和維持起關(guān)鍵作用的代謝物，但這尚未納入微生物腐蝕代謝組學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，但此類(lèi)分析方法已用于識(shí)別其他應(yīng)用中的生物標(biāo)志物[22]。

2 代謝組學(xué)在微生物腐蝕研究中的應(yīng)用進(jìn)展

微生物腐蝕的一個(gè)特點(diǎn)是差異性巨大，微生物的群落組成在不同環(huán)境之間是不同的，甚至是在兩個(gè)相近腐蝕位點(diǎn)之間也是不同的[23]。雖然宏基因組學(xué)已成功用于識(shí)別腐蝕中的不同微生物及其相對(duì)豐度[24]，但不可能直接將微生物的相對(duì)豐度與微生物腐蝕中的致腐蝕作用聯(lián)系起來(lái)。例如，雖然SRB廣泛存在于腐蝕環(huán)境中，并扮演著重要的角色，但它們并不總是群落中最豐富的致腐蝕的微生物。研究顯示，在美國(guó)發(fā)生微生物腐蝕現(xiàn)象的天然氣輸送管道中，SRB僅占微生物種群的1%左右，而反硝化菌占4%，產(chǎn)甲烷菌則占13%[25]。即使是在不同的腐蝕環(huán)境中，不同組成的微生物群落仍表現(xiàn)出相對(duì)相似的微生物腐蝕水平，僅僅靠識(shí)別腐蝕環(huán)境中存在的微生物不可能全面了解該系統(tǒng)中發(fā)生的微生物腐蝕。理解微生物群落及其與金屬表面相互作用不能僅僅是基于群落中存在的微生物，還應(yīng)基于群落中微生物的代謝功能。

2.1 在微生物腐蝕研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)方法可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，靶向代謝組學(xué)用于研究一小部分代謝物的變化，這些代謝物是根據(jù)先驗(yàn)知識(shí)預(yù)先選擇的。由于這些代謝物是已知的，因此通?？梢杂眉儤?biāo)準(zhǔn)品來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并量化不同樣品中代謝物的濃度[26]。

在微生物腐蝕的背景下，靶向代謝組學(xué)可用于量化已知與微生物腐蝕相關(guān)的微生物群落的代謝物水平，例如乙酸和丙酸。如果有來(lái)自同一微生物群落的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本，也可以確定這些假定的生物標(biāo)志物代謝物水平的縱向或時(shí)間變化，以深入了解微生物群落中發(fā)生的代謝反應(yīng)和腐蝕過(guò)程。在一項(xiàng)研究中，Beale等[27]直接使用從農(nóng)村供水管網(wǎng)中獲得的水進(jìn)行代謝組學(xué)分析，確定了管道生物膜所表達(dá)的細(xì)胞外代謝物。隨即又?jǐn)U展了這項(xiàng)工作，成功地得到了一些水樣的細(xì)胞外代謝組概況，確定了關(guān)鍵的代謝組生物標(biāo)志物。在后續(xù)的研究中，通過(guò)從發(fā)生腐蝕微生物腐蝕的管道生物膜中提取分離微生物，分別在不暴露于銅和暴露于低水平的銅下進(jìn)行了分析。根據(jù)它們的活性和銅暴露情況進(jìn)行區(qū)分，研究發(fā)現(xiàn)，兩組試驗(yàn)中的微生物的代謝活動(dòng)會(huì)根據(jù)微生物代謝銅的能力而變化。這證明了代謝組學(xué)方法對(duì)于區(qū)分由類(lèi)似的微生物組成，但是經(jīng)歷了不同的物理化學(xué)活動(dòng)(如腐蝕和抑制腐蝕)的水網(wǎng)生物膜的類(lèi)別的可行性。Guo等[28]運(yùn)用精準(zhǔn)靶向代謝組學(xué)和遺傳學(xué)整合策略，從代謝的角度解讀大腸桿菌生物膜的形成機(jī)制，在大腸桿菌生物膜體系當(dāng)中精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證若干具有調(diào)控生物膜形成的功能代謝產(chǎn)物，并初步闡明鐵載體生物合成介導(dǎo)的鐵離子調(diào)控功能代謝物表達(dá)，進(jìn)而影響生物膜形成的代謝機(jī)理。研究首次確定了5種能有效調(diào)節(jié)生物膜形成的功能代謝物(L-色氨酸、L-亮氨酸、亞精胺、50-MTA 和CMP)，初步探明了深層次的腐蝕機(jī)理，研究了基于功能代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)控解離微生物生物膜形成的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)錳可以通過(guò)調(diào)節(jié)表型形態(tài)和代謝重編程來(lái)抑制生物膜的形成，發(fā)現(xiàn)了16種不同的功能代謝物和相關(guān)的三種代謝途徑，包括糖酵解、TCA循環(huán)和色氨酸代謝，這些代謝途徑在生物膜形成過(guò)程中主要被錳改變[29]。

與靶向代謝組學(xué)相比，非靶向代謝組學(xué)可用于確定樣本中存在的多種代謝物的相對(duì)豐度[30]。非靶向代謝組學(xué)用于微生物腐蝕時(shí)，可以確定與微生物腐蝕相關(guān)的微生物群落中存在的不同代謝物的水平。Brauer等[31]研究了1018碳鋼表面海洋細(xì)菌生物膜的化學(xué)組成與生物膜下鋼的腐蝕損傷之間的相關(guān)性，首次成功地對(duì)腐蝕金屬材料上的海洋生物膜進(jìn)行了環(huán)境化學(xué)和代謝組學(xué)成像。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，一些特定的代謝物與碳鋼基底中腐蝕的發(fā)生和程度密切相關(guān)，而其他的則不相關(guān)。基于上述結(jié)果，他們認(rèn)為生物膜代謝組與腐蝕程度和性質(zhì)之間的空間相關(guān)性可以作為微生物腐蝕研究的一個(gè)有用指標(biāo)。通過(guò)對(duì)不同微生物腐蝕地點(diǎn)的微生物群落進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，有助于識(shí)別不同地點(diǎn)的微生物代謝，同時(shí)可以幫助識(shí)別與微生物腐蝕位置相關(guān)的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。例如，Bonifay等[32]將琥珀酸確定為挪威地區(qū)腐蝕管道特有的代謝產(chǎn)物。

2.2 在微生物腐蝕早期預(yù)測(cè)中取得的成果

特定代謝物的存在與否以及相關(guān)微生物群落組成與腐蝕之間的關(guān)系，可以理解為類(lèi)似于胃腸道中某些微生物和微生物代謝物的存在與否被用來(lái)推斷人體疾病的原因和后果[33]。如果在受微生物腐蝕影響的位置檢測(cè)到特定代謝物，則可能表明該位置微生物群落中發(fā)生了與代謝物形成或消耗相關(guān)的代謝反應(yīng)，就可以推斷在這個(gè)系統(tǒng)中發(fā)生了微生物腐蝕。如果在多個(gè)受微生物腐蝕影響的位置檢測(cè)到相同的代謝產(chǎn)物，這可能表明導(dǎo)致該代謝物產(chǎn)生的代謝反應(yīng)在微生物腐蝕機(jī)制中具有重要作用。這項(xiàng)信息再與群落組成信息相結(jié)合，可以識(shí)別在不同位置對(duì)微生物腐蝕都有貢獻(xiàn)的微生物。因此，對(duì)微生物群落的代謝物足跡進(jìn)行分類(lèi)研究，對(duì)于研究微生物腐蝕中的腐蝕機(jī)制具有重要的意義，在一定程度上可以預(yù)測(cè)微生物腐蝕的發(fā)生。

代謝組學(xué)通過(guò)分析微生物因其代謝活性而消耗或排泄的代謝物來(lái)推斷生物膜活性，具有監(jiān)測(cè)城市水網(wǎng)生物膜中微生物活性的潛力。Beale等[34]對(duì)發(fā)生藍(lán)綠水現(xiàn)象的管道的水進(jìn)行分析，用熒光光譜法快速、簡(jiǎn)便地監(jiān)測(cè)配水網(wǎng)絡(luò)和建筑管網(wǎng)中是否存在細(xì)胞外代謝物，用GC-MS進(jìn)一步研究和鑒定相關(guān)的細(xì)胞外代謝物。以此可以確定生物膜的狀態(tài)或類(lèi)型，從而確定微生物腐蝕的特征，將來(lái)隨著特定代謝物與不同微生物的相關(guān)性研究的增加將進(jìn)一步增強(qiáng)該工具的實(shí)用性。

根據(jù)群落中存在的生物的代謝反應(yīng)產(chǎn)物描述微生物群落的功能是建立在這樣一個(gè)假設(shè)之上的，即微生物群落是基于群落不同成員之間的代謝反應(yīng)相互作用而形成和維持的[35]。在這個(gè)模型中，假設(shè)一種微生物產(chǎn)生的分子被另一種微生物利用，不同微生物之間的這種合作是群落形成和維持的基礎(chǔ)。由于不同的微生物都具有一系列執(zhí)行相同生化和酶促反應(yīng)的代謝機(jī)制，因此群落可能具有不同的組成，但仍在進(jìn)行一組相似的反應(yīng)。事實(shí)上，最近的幾項(xiàng)微生物腐蝕研究指出微生物群落產(chǎn)生的分子足跡或代謝物是微生物腐蝕發(fā)生和維持的關(guān)鍵因素。表3是從發(fā)生微生物腐蝕的銅管道生物膜中確定的代謝物特征，這些研究發(fā)現(xiàn)，暴露于銅和未暴露于銅的微生物之間的代謝物主要區(qū)別在于氨基酸的存在，以及羧酸的消耗和表達(dá)，而這些有機(jī)酸在腐蝕中起著重要的作用。為了可以更全面了解管道生物膜的影響，需要研究各種管道生物膜在不同混合菌種和暴露條件下的代謝組，這可能需要大量的試驗(yàn)工作，并形成大量數(shù)據(jù)的集合，才有助于形成更完整的管道微生物群代謝組，代謝物表達(dá)與管道生物膜內(nèi)微生物之間的關(guān)系就可以通過(guò)代謝物鑒定來(lái)推斷。

表3 從發(fā)生微生物腐蝕的銅管道生物膜中確定的代謝物特征Table 3 Characteristics of metabolites determined from biofilm of copper pipeline with microbial corrosion

另外，Bonifay等[32]也在微生物腐蝕研究中經(jīng)常觀察到羧酸。例如，乙酸和酯、丙酸和琥珀酸是最常見(jiàn)的羧酸，其他羧酸如草酸和馬來(lái)酸也被認(rèn)為是關(guān)鍵的微生物腐蝕相關(guān)代謝物，除了羧酸外還發(fā)現(xiàn)了氨基酸和脂肪酸。盡管不常見(jiàn)，但在微生物腐蝕研究中，脂肪醇(如十六醇[27])以及糖磷脂[31]也都有很高的豐度，因此也被認(rèn)為是關(guān)鍵的微生物腐蝕相關(guān)代謝物。除了所有這些類(lèi)別的化合物外，還發(fā)現(xiàn)了與碳水化合物代謝相關(guān)的幾種化合物與微生物腐蝕有關(guān)。

上述研究為利用代謝組學(xué)研究微生物腐蝕提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。具體而言，這些研究表明，氨基酸、羧酸、脂肪酸和脂肪醇可能是用于代謝組學(xué)分析微生物腐蝕的理想候選物。至于是否可以作為微生物腐蝕研究的生物標(biāo)志物，還需要進(jìn)行更詳細(xì)深入的研究。

2.3 在腐蝕機(jī)理研究方面取得的成果

代謝組學(xué)的應(yīng)用有助于代謝產(chǎn)物酸腐蝕理論的研究，將微生物群落和代謝產(chǎn)物信息與檢測(cè)微生物的位置所特有的腐蝕機(jī)理知識(shí)結(jié)合起來(lái)，可以全面研究微生物群落與金屬表面之間的相互作用。比如基于硫酸鹽還原細(xì)菌(SRB)等微生物是否直接使用金屬進(jìn)行新陳代謝，或諸如產(chǎn)酸細(xì)菌等微生物是否通過(guò)產(chǎn)生腐蝕性代謝物導(dǎo)致腐蝕。細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移微生物腐蝕和代謝物微生物腐蝕被認(rèn)為是可能的微生物腐蝕機(jī)制[39]。

除了群落結(jié)構(gòu)外，鑒定群落產(chǎn)生的代謝物可以使我們更全面地了解微生物腐蝕中復(fù)雜的微生物和電化學(xué)之間的相互作用[30]。已經(jīng)證明，生物膜的形成是在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)由微生物分泌的胞外聚合物(EPS)而形成的[40]。Keevil 等[41]將生物膜描述為一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其由包裹在EPS中的小菌落排列組成，但在這些小菌落堆疊之間具有顯著的通道，便于擴(kuò)散。它們是大量水合的凝膠狀薄膜，會(huì)對(duì)腐蝕過(guò)程產(chǎn)生物理影響[42]，如果在表面上不均勻分布，會(huì)導(dǎo)致在金屬基底上建立永久的陽(yáng)極和陰極區(qū)域。然而，生物膜對(duì)環(huán)境具有高度反應(yīng)性，生物膜的存活需要營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)移到內(nèi)部，因此，該膜不能發(fā)揮完全屏障的作用。這種開(kāi)放結(jié)構(gòu)意味著生物膜也可以含有氧化的腐蝕產(chǎn)物，甚至還可以包含特定的區(qū)域，在該區(qū)域中某些化學(xué)物質(zhì)的擴(kuò)散受到限制。例如，一組微生物的活動(dòng)可能會(huì)阻礙或促進(jìn)其他微生物的發(fā)展，SRB和鐵還原細(xì)菌(IRB)之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)，因此IRB可能會(huì)降低SRB的活性。相比之下，產(chǎn)酸細(xì)菌除了本身具有腐蝕性之外，還可以提供有益于SRB生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件。而生物膜和微生物對(duì)腐蝕的主要影響是通過(guò)改變陽(yáng)極或陰極反應(yīng)的速度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

如果陽(yáng)極或陰極過(guò)程的反應(yīng)物和/或產(chǎn)物不能自由進(jìn)出金屬表面，腐蝕速率可能是擴(kuò)散受限或濃度受限的。Videla等[42]研究了微生物的呼吸過(guò)程如何改變金屬界面的氧濃度，如果生物膜覆蓋整個(gè)表面，這可能導(dǎo)致陰極反應(yīng)速率的降低和腐蝕的減少，或者，如果涂層是不完整的，可能會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)局部腐蝕的電位梯度。Edyvean等[43]闡述了后一種情況，即生物膜通過(guò)形成與飲用水管道中的結(jié)節(jié)相關(guān)的氧氣電池來(lái)加速腐蝕。除了氧梯度，化合物和pH梯度也可以在生物膜內(nèi)產(chǎn)生，并可以驅(qū)動(dòng)腐蝕過(guò)程。此外，酸性代謝物的產(chǎn)生可以通過(guò)溶解保護(hù)膜和提供氧化劑(即質(zhì)子)來(lái)增加陰極過(guò)程[43]，顯著降低局部pH值。Terry等[44]指出pH值的差異可能高達(dá)9個(gè)單位。硫氧化細(xì)菌可以在pH<2的情況下產(chǎn)生硫酸。利用氮的細(xì)菌、真菌和微藻也能產(chǎn)酸，這種局部酸區(qū)可以溶解任何保護(hù)膜，加速腐蝕進(jìn)行。Duncan等[45]直接在管道表面沉積物中檢測(cè)固著的生物和代謝物，發(fā)現(xiàn)了嗜熱產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷菌、同養(yǎng)細(xì)菌、硫代硫酸鹽還原細(xì)菌和SRB。這些微生物可以通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸、CO2、硫物質(zhì)以及通過(guò)氫氧化和鐵還原來(lái)促進(jìn)金屬腐蝕。

2.4 在微生物腐蝕研究方面的發(fā)展趨勢(shì)

將代謝組學(xué)納入微生物腐蝕研究的最后一步，也是極其重要的一步，是將代謝數(shù)據(jù)與微生物群落組成信息相結(jié)合。這不僅可以驗(yàn)證觀察到的結(jié)果，還可以幫助識(shí)別參與代謝反應(yīng)的微生物群落成員。而且，當(dāng)兩者結(jié)合時(shí)，這些技術(shù)的局限性可以得到改善。正如Noecker等[46]使用16SrRNA測(cè)序分析微生物的群落，利用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)群落的基因組含量。然后，預(yù)測(cè)的基因含量信息可用KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)的反應(yīng)信息來(lái)推斷群落的代謝潛力。這種方法既考慮了特定群體成員代謝物的產(chǎn)生，也考慮了其他群體成員代謝物的消耗，并預(yù)測(cè)了宏基因組中不同基因?qū)Υx物水平增加或減少的相對(duì)貢獻(xiàn)。預(yù)測(cè)的代謝產(chǎn)物表達(dá)可以與實(shí)際代謝組學(xué)數(shù)據(jù)建立聯(lián)系，并且這種聯(lián)系用于識(shí)別有助于群落產(chǎn)生特定代謝物的關(guān)鍵微生物。

盡管代謝組學(xué)在識(shí)別微生物腐蝕中的生物標(biāo)志物和關(guān)鍵微生物方面具有很高的潛力，但要將其從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)樾袠I(yè)中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，仍然需要克服一些技術(shù)限制。從方法學(xué)的角度來(lái)看，由于微生物產(chǎn)生的代謝物性質(zhì)的多樣性，單一分析方法無(wú)法檢測(cè)和識(shí)別樣本中的所有代謝物[47]。因此，可能需要使用多種方法來(lái)增加代謝組覆蓋率。為了使非揮發(fā)性化合物與GC-MS兼容，或者為了提高LC-MS的穩(wěn)定性和與液相色譜柱的結(jié)合，通常需要化學(xué)衍生。然而，化學(xué)衍生已被證明會(huì)導(dǎo)致意外副產(chǎn)物的形成，從而導(dǎo)致對(duì)化合物濃度的誤判。由于代謝物會(huì)快速降解，而且不同樣品之間代謝產(chǎn)物組成的顯著差異可能僅僅來(lái)自樣品處理，因此在對(duì)現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析之前，使用正確的儲(chǔ)存條件和樣品保存技術(shù)也很重要。限制代謝組學(xué)應(yīng)用于微生物腐蝕的另一個(gè)相關(guān)因素是，在樣品采集和制備過(guò)程中，代謝物的空間分布信息會(huì)丟失。最后，用于識(shí)別代謝物的數(shù)據(jù)庫(kù)包含關(guān)于化合物的信息通常不夠完整，較少的信息量可能會(huì)限制識(shí)別代謝物的能力。

多種微生物或優(yōu)勢(shì)微生物往往共同影響著腐蝕的行為，微生物腐蝕研究中要高度關(guān)注微生物之間的相互作用，盡可能貼近真實(shí)的微生物腐蝕環(huán)境。然而，該領(lǐng)域的研究仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。一方面是無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室中再現(xiàn)微生物所處的復(fù)雜環(huán)境，缺少對(duì)微生物腐蝕的原位研究。另一方面，實(shí)驗(yàn)室中是基于可培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的生物膜系統(tǒng)，簡(jiǎn)化了研究，忽略了不可培養(yǎng)微生物在多物種生物膜中的作用。未來(lái)的研究應(yīng)更加關(guān)注自然環(huán)境中的復(fù)雜微生物群落，雖然大多數(shù)MS方法不能用于獲得代謝物空間定位信息，但新興的MS技術(shù)，如成像質(zhì)譜(IMS)可用于微生物生物膜中代謝物空間組織的原位分析，腐蝕中各微生物之間相互作用機(jī)理研究還需要一個(gè)從量變到質(zhì)變的過(guò)程，將來(lái)隨著研究的不斷增多和深入，可以通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)出多種微生物腐蝕的作用機(jī)理。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，代謝組學(xué)已廣泛地用于微生物腐蝕的研究，為微生物腐蝕研究提供了全面系統(tǒng)的分析手段。在過(guò)去30年內(nèi)得到迅速發(fā)展并滲透到多項(xiàng)領(lǐng)域，在科學(xué)研究與應(yīng)用方面具有巨大潛力。

在研究微生物腐蝕方面代謝組學(xué)方法比其他分子方法更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榇x組學(xué)數(shù)據(jù)提供了微生物群落中發(fā)生的生化反應(yīng)的最終產(chǎn)物的信息，并且更適于早期檢測(cè)微生物腐蝕的生物標(biāo)志物。聯(lián)系微生物群落組成和功能的數(shù)據(jù)來(lái)解釋微生物腐蝕機(jī)制也很重要，因此，有必要將微生物群落信息與腐蝕機(jī)制知識(shí)相結(jié)合，以便全面研究微生物群落和金屬表面之間的相互作用。

未來(lái)可以涵蓋生物體系中多種更廣闊的代謝產(chǎn)物的分析方法將成為研究的重點(diǎn)。同時(shí)，為了能有效地從龐大的數(shù)據(jù)中獲取有用的信息，需要將生物信息學(xué)技術(shù)與代謝物組學(xué)更加緊密地結(jié)合，而分析統(tǒng)計(jì)學(xué)、代謝物組分析、數(shù)據(jù)處理分析及可視化軟件的發(fā)展能更好幫助我們了解環(huán)境及基因變化對(duì)于微生物代謝網(wǎng)絡(luò)和微生物腐蝕的影響。