舒芬太尼減輕大鼠肝缺血再灌注損傷的機制研究

馬祥倜，殷姜文，武園園，謝麗萍

肝缺血再灌注損傷（HIRI）主要由創(chuàng)傷、肝移植或休克引起，是一種常見且不可避免的并發(fā)癥［1］。HIRI可導(dǎo)致嚴重的肝組織損傷和功能障礙，主要表現(xiàn)為肝細胞凋亡和氧化應(yīng)激［2-3］。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一種多功能細胞因子，通過啟動TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［4］。研究證實，激活的TGF-β信號通路參與了細胞的識別、分化、增殖和凋亡等多種過程［5］。另有研究表明，Smad蛋白是TGF-β信號通路中的主要效應(yīng)分子，TGF-β可通過典型信號通路（Smad通路）以及非典型信號通路（非Smad通路）調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］。舒芬太尼因其鎮(zhèn)痛作用強、起效迅速、血流動力學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于圍手術(shù)期。研究表明，舒芬太尼預(yù)處理可以抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路，減輕HIRI［7］。MAPK包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），他們在HIRI中起著關(guān)鍵作用［8］。p38 MAPK可以獨立轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β信號，也可以與Smad蛋白通過交互對話的方式協(xié)同調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。然而，目前有關(guān)TGF-β/Smad通路是否參與了舒芬太尼預(yù)處理對HIRI的保護作用及可能機制尚不明確。本研究就此做一探討，以期為圍手術(shù)期肝保護研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑舒芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)有限公司（批號：11A01121）。TGF-β1抑制劑（SB-431542）和TGFβ1激動劑（SRI-011381）購自MCE公司。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自Servicebio公司。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。原位末端標記法（TUNEL）試劑盒購自Servicebio公司。TGF-β1抗體（兔抗，ab215715）購 自Abcam公 司。Smad2/3抗 體（兔 抗，abs146156）、p-Smad2/3抗體（兔抗，abs130992）購自Absin公司。p38抗體（兔抗，bs-0637R）、p-p38抗體（兔抗，bs-0636R）購自Bioss公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆一抗（兔抗，GB11002）購自Servicebio公司。山羊抗兔二抗（G1213-100UL）購自Servicebio公司。4’，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亞砜（DMSO）、電化學(xué)發(fā)光液（ECL）、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑購自Servicebio公司。

1.2 實驗動物與分組清潔級健康2月齡雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～240 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號：SXXK（魯）20190003，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，使其處于通風(fēng)良好，溫度21～23℃，濕度45%～55%，光照和黑夜（12 h/12 h）相對恒定的環(huán)境中，可自由攝食、飲水。采用隨機數(shù)字表法將其分為假手術(shù)（S）組、HIRI（IR）組、舒芬太尼預(yù)處理+HIRI（SF）組、TGF-β1抑制劑+舒芬太尼預(yù)處理+HIRI（SB）組、TGF-β1激動劑+舒芬太尼預(yù)處理+HIRI（SRI）組和DMSO+HIRI（DMSO）組，每組8只。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立與給藥方法各組大鼠術(shù)前禁食6 h，自由飲水至術(shù)前2 h，手術(shù)前稱取質(zhì)量，使用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定于恒溫手術(shù)臺上，取仰臥位行氣管插管術(shù)后連接小動物呼吸機行機械輔助通氣。呼吸機參數(shù)設(shè)置：呼吸頻率60～65次/min，潮氣量15 mL/kg，吸呼比4∶5。隨后行股靜脈穿刺置管。參照文獻［10］建立大鼠局部HIRI模型：造成約70%肝臟缺血，可見被阻斷肝葉顏色變?yōu)榛野?，夾閉血管30 min后松開止血夾形成再灌注，此時被阻斷肝葉顏色恢復(fù)紅潤。S組僅開腹，不做其他處理；IR組采用上述方法建立HIRI模型，缺血30 min，再灌注4 h；SF組將10 μg/kg的舒芬太尼用生理鹽水稀釋到0.3 mL，缺血前經(jīng)股靜脈按0.1 mL/min泵入，30 min后再按IR組處理；SB組和SRI組在舒芬太尼預(yù)處理前，分別腹腔注射TGF-β1的抑制劑（SB-431542）和激動劑（SRI-011381），抑制劑和激動劑均按15 mg/kg給藥并用DMSO稀釋至3 mL，經(jīng)腹腔注射30 min后按SF組處理；DMSO組于術(shù)前30 min腹腔內(nèi)注射DMSO 3 mL，隨后按IR組處理，48只大鼠均造模成功。S組于開腹、暴露第一肝門4 h后安樂死大鼠，獲取新鮮肝臟、血清等樣本用于后續(xù)研究，其余各組分別于再灌注后4 h取材。

1.3.2 HE染色觀察肝組織的形態(tài)變化 取新鮮肝左葉2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，立即固定于4%多聚甲醛中，24 h后常規(guī)行石蠟包埋、切片（4 μm），HE染色，光鏡下（×400）觀察肝組織的形態(tài)變化。

1.3.3 ALT和AST水平檢測 采集新鮮腹主動脈血5 mL，常溫下以3 500 r/min離心10 min，收集上層血清液，嚴格按照試劑盒說明書要求操作，檢測血清ALT和AST水平。

1.3.4 MDA和SOD水平檢測 取新鮮肝左葉100 mg，制成10%組織勻漿，按照試劑盒說明書的要求檢測各組肝組織MAD和SOD水平。

1.3.5 TUNEL法檢測肝細胞凋亡率 石蠟切片進行脫蠟、蛋白酶K修復(fù)，加入TUNEL反應(yīng)液，置于濕盒內(nèi)，37℃避光孵育2 h，滴加DAPI溶液染核5 min，TUNEL陽性細胞核為紅色，封片后在200倍熒光顯微鏡下，隨機讀取5個視野，使用Image J軟件分析并計數(shù)各視野下肝組織陽性細胞數(shù)量，并計算其細胞凋亡率。

1.3.6 Western blot法檢測肝組織TGF-β1及Smad2/3、p-Smad2/3、p38、p-p38蛋白表達 取約100 mg肝組織放入預(yù)冷的研缽中碾碎，加入1 mL RIPA裂解液、10 μL蛋白酶抑制劑（100 mmol/L）和10 μL磷酸化蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取10 μg蛋白樣本行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶或5%BSA室溫封閉后進行TGF-β（11∶1 000）、Smsd2/3（1∶1 000）、p-Smad2/3（1∶1 000）、p38（1∶1 500）、p-p38（1∶1 500）蛋白一抗孵育過夜，洗膜，室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h，滴加ECL后曝光，蛋白條帶用Image J進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織細胞形態(tài)變化S組肝細胞形態(tài)基本正常，IR組及DMSO組可見肝細胞廣泛壞死、大量炎性細胞浸潤及肝竇內(nèi)少量淤血；SF組可見部分肝細胞壞死，炎性細胞的浸潤減少；SB組損傷較SF組加重，表現(xiàn)為肝組織結(jié)構(gòu)不清，大量炎性細胞浸潤及肝竇內(nèi)大量淤血；SRI組損傷程度較SF組減輕，僅可見少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.2 各組大鼠血清生化水平比較與S組比較，其余各組ALT、AST、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）。與IR組比較，SF組和SRI組ALT、AST、MDA水平降低，SOD水平升高（P＜0.05），SB組ALT、AST、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05），而DMSO組各指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與SF組比較，SB組ALT、AST、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05），SRI組ALT、AST水平降低，SOD水平升高（P＜0.05），見表1。

2.3 各組大鼠肝細胞凋亡率比較S組、IR組、SF組、SB組、SRI組肝細胞凋亡率（%）分別為0、7.69±0.22、3.04±0.27、9.41±0.39、1.53±0.33，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=8，F(xiàn)=650.700，P＜0.01）。其中，與S組比較，IR組、SF組、SB組、SRI組肝細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與IR組比較，SF組和SRI組肝細胞凋亡率降低，SB組升高（P＜0.05）；與SF組比較，SB組肝細胞凋亡率升高，SRI組降低（P＜0.05），見圖2。

Tab.1 Comparison of ALT,AST,MDA and SOD after 4 hours of IR between the six groups表1各組缺血再灌注4 h后血清ALT、AST、MDA及SOD水平比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of ALT,AST,MDA and SOD after 4 hours of IR between the six groups表1各組缺血再灌注4 h后血清ALT、AST、MDA及SOD水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與IR組比較，c與SF組比較，P＜0.05。

組別S組IR組SF組SB組SRI組DMSO組F ALT（U/L）45.33±6.96 808.70±24.38a 453.70±23.96ab 971.00±29.06abc 226.40±18.25abc 807.70±16.60ac 2 442.000＊＊AST（U/L）80.66±11.56 1 125.00±106.70a 653.40±30.85ab 1 593.00±204.30abc 368.80±22.93abc 1 135.00±16.50ac 184.700＊＊MDA（μmol/g）0.28±0.03 0.85±0.04a 0.67±0.04ab 1.26±0.12abc 0.38±0.05ab 0.88±0.05ac 263.400＊＊SOD（U/mg）263.70±14.69 143.80±6.61a 183.20±8.20ab 98.08±4.44abc 223.50±12.28abc 141.40±9.09ac 302.800＊＊

2.4 各組大鼠肝組織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、p38、p-p38蛋白相對表達水平比較與S組比較，IR組、SF組、SRI組TGF-β1、p-Smad2/3、p-p38蛋白表達水平升高（P＜0.05），SB組TGF-β1、p-p38蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與IR組比較，SF、SRI組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平升高，p-p38蛋白表達水平降低（P＜0.05），SB組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平降低，p-p38蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與SF組比較，SB組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平降低，p-p38蛋白表達水平升高（P＜0.05），SRI組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平升高，p-p38蛋白表達水平降低（P＜0.05）。各組Smad2/3、p38蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、圖3。

3 討論

ALT和AST是臨床常被用來評價肝功能的2個指標，ALT主要存在于肝細胞內(nèi)，AST則主要表達于肝細胞的線粒體中。正常情況下，ALT和AST在血清中的水平很低。然而，當肝細胞遭到破壞時，ALT和AST被釋放入血，在一定范圍內(nèi)，血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平越高表示肝細胞損傷程度越重。在本研究中，相較于S組，IR組大鼠ALT、AST水平較高且肝組織損傷程度較重，肝細胞凋亡率升高，提示HIRI模型制備成功。與IR組相比，SF組血清中ALT、AST水平降低，肝組織損傷程度減輕，肝細胞凋亡率也降低，提示舒芬太尼預(yù)處理對HIRI具有保護作用，其機制可能是通過減輕肝細胞凋亡來實現(xiàn)。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物之一，SOD是機體重要的內(nèi)源性抗氧化酶，能夠清除氧自由基和脂質(zhì)過氧化物。隨著肝缺血結(jié)束和再灌注開始，氧化應(yīng)激是體內(nèi)最先發(fā)生的變化之一［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，IR組大鼠MDA水平高于與S組，SOD水平低于S組，經(jīng)舒芬太尼預(yù)處理后，大鼠MDA生成減少，SOD水平增多，提示舒芬太尼預(yù)處理對HIRI的保護作用也可能是通過抑制肝細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn)。

Vahid等［12］在研究芹菜素對肝缺血再灌注損傷作用的實驗中發(fā)現(xiàn)，與腹腔預(yù)先注射DMSO的HIRI大鼠相比，HIRI大鼠凋亡調(diào)控基因Bcl-2（抗凋亡）和Bax（促凋亡）的表達水平無明顯差異。本研究結(jié)果顯示，DMSO組與IR組大鼠血清ALT、AST、MDA、SOD水平差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，筆者推測DMSO對HIRI模型無保護或傷害作用。

Fig.2 TUNEL staining results in each group(×200)圖2各組大鼠肝細胞TUNEL染色圖（×200）

Tab.2 Comparison the expression levels of TGF-β1,Smad2/3,p-Smad2/3,p38 and p-p38 protein between the five groups表2各組TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、p38、p-p38蛋白表達水平比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison the expression levels of TGF-β1,Smad2/3,p-Smad2/3,p38 and p-p38 protein between the five groups表2各組TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、p38、p-p38蛋白表達水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與IR組比較，c與SF組比較，P＜0.05。

組別S組IR組SF組SB組SRI組F TGF-β1 0.548±0.004 1.497±0.015a 1.929±0.020ab 0.930±0.022abc 2.064±0.050abc 1 710.000＊＊Smad2/3 1.028±0.056 0.985±0.007 0.998±0.005 0.984±0.017 0.983±0.023 1.383 p-Smad2/3 0.674±0.014 0.851±0.039a 1.152±0.015ab 0.707±0.008bc 1.592±0.048abc 511.800＊＊p38 1.053±0.005 1.034±0.020 1.038±0.018 1.034±0.006 1.034±0.008 1.250 p-p38 0.287±0.002 3.627±0.132a 1.941±0.066ab 4.127±0.293abc 1.041±0.062abc 365.100＊＊

Fig.3 Comparison of expressions of TGF-β1,Smad2/3,p-Smad2/3,p38 and p-p38 protein between the five groups圖3各組TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、p38、p-p38蛋白表達情況比較

為了驗證TGF-β/Smad通路是否參與了舒芬太尼預(yù)處理對HIRI的保護作用，本實驗預(yù)先給大鼠分別注射了TGF-β1抑制劑和激動劑，隨后再注射舒芬太尼并模擬大鼠HIRI處理。與SF組比較，當預(yù)先給予TGF-β1抑制劑后，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平降低，HE染色結(jié)果顯示肝組織的損傷程度加重，ALT、AST、MDA水平升高，SOD水平降低，肝細胞凋亡率升高；而當預(yù)先給予TGF-β1激動劑后，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平升高，各項肝功能指標好轉(zhuǎn)，表明當TGF-β1的表達受到抑制時舒芬太尼的肝臟保護作用被減弱，而當TGF-β1的表達增強時舒芬太尼的保護作用也隨之增強。已有研究證實，激活TGF-β/Smad通路對經(jīng)受缺血再灌注損傷的心肌可產(chǎn)生保護作用［13］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，TGF-β典型信號通路下游Smad2/3磷酸化形成的p-Smad2/3蛋白表達水平與TGF-β1在不同處理組間呈相同的變化趨勢。因此，筆者推測，舒芬太尼預(yù)處理對HIRI產(chǎn)生的保護效應(yīng)可能是通過誘導(dǎo)TGF-β/Smad信號通路的激活來實現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與S組相比p-p38蛋白表達水平在IR組和SF組均升高，且IR組升高程度高于SF組，表明p38的活化可能會加重HIRI。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制JNK、p38 MAPK信號通路可減輕缺血再灌注損傷［14］。然而，對于TGF-β參與的多個信號通路是否通過相互作用，參與舒芬太尼預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用研究鮮見。本研究發(fā)現(xiàn)，與SF組比較，SB組p-p38蛋白表達水平升高，而SRI組pp38蛋白表達水平降低，表明TGF-β1與p-p38間可能存在著某些負性調(diào)控，TGF-β1抑制了p38 MAPK的磷酸化過程，從而使舒芬太尼預(yù)處理對HIRI產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，舒芬太尼預(yù)處理可能通過激活TGFβ/Smad信號通路和抑制p38 MAPK的磷酸化，減輕肝細胞凋亡和氧化應(yīng)激，最終發(fā)揮對大鼠HIRI的保護作用。