lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制研究

陳霄，吳小穎，安明

卵巢癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，全世界每年大約有24萬例卵巢癌新發(fā)病例和15萬例卵巢癌死亡病例［1］。在現(xiàn)有治療技術(shù)和方案中，卵巢癌患者預(yù)后仍普遍較差，5年生存率約為47%［2］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）長度超過200個(gè)核苷酸，缺乏轉(zhuǎn)錄能力，但可以調(diào)控細(xì)胞的生長、遷移、運(yùn)動(dòng)、分化和凋亡等生物學(xué)過程，lncRNA異常表達(dá)在包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，可作為抗腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)［3-4］。RNA SRY-box轉(zhuǎn) 錄 因 子21反 義RNA 1（SOX21-AS1）是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其可通過與miR-7競爭性結(jié)合并增加VDAC1的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［5］。lncRNA SOX21-AS1在乳腺癌中高表達(dá)，通過促進(jìn)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路的活性，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。然而，目前鮮見有關(guān)卵巢癌中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1表達(dá)情況及作用的相關(guān)研究。Wnt/βcatenin信號通路是與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)的經(jīng)典信號通路，在卵巢癌中通常處于激活狀態(tài)［7］。Gai等［8］研究證實(shí)，lncRNA SOX21-AS1在腦膠質(zhì)瘤中可通過激活Wnt/β-catenin信號通路而發(fā)揮致癌作用。本研究旨在探討lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌中的表達(dá)水平及其與卵巢癌的惡性進(jìn)展的關(guān)系及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑來源TRIzol試劑和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT Master Mix和One Step TB Green PrimeScript實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工技術(shù)有限公司合成；卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、OVCR3和人卵巢正常上皮細(xì)胞HOSE購自中科院上海細(xì)胞庫；NC siRNA或lncRNA SOX21-AS1 siRNA由上海吉瑪基因技術(shù)有限公司提供；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；MTS試劑購自上海同仁化學(xué)技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔源Wnt3a、β-catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7、鼠源Cyclin D1和cMyc抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自美國proteintech公司。

1.2 臨床組織樣本選取2020年1月—2021年10月于四川大學(xué)華西三亞醫(yī)院收治的卵巢癌患者，從75例患者中分別獲取卵巢癌組織及其鄰近的癌旁組織。將手術(shù)新鮮切除的標(biāo)本經(jīng)無RNA酶的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，經(jīng)液氮處理后于-80℃保存?zhèn)溆谩＜{入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未接受過化療、放療或其他形式的治療；病理類型為上皮性卵巢癌；臨床病理和隨訪資料完整。本研究根據(jù)世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言進(jìn)行，經(jīng)我院倫理機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 qPCR檢測lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)根據(jù)TRIzol試劑說明書，提取卵巢癌和癌旁組織中RNA，采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定260 nm和280 nm的吸光度（A）值，以A260/A280判斷總RNA的濃度和純度。以RNA作為模板，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒以30℃5 min，42℃30 min，85℃5 min反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SOX21-AS1引物：上游5'-CCGATGGGAAACCCCCAATC-3'，下游5'-AACGCTT?GCTCAAGCCTCAT-3'；U6：上游5'-GCTTCGGCAGCA?CATATACTAAAAT-3'，下 游5'-CGCTTCACGAATTTGCGT?GTCAT-3'。以cDNA為模板，One Step TB Green PrimeScript RT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 min，56℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。獲得樣品的循環(huán)閾值（Ct值）。以U6為 內(nèi) 部參 照，采 用2-ΔΔCt法 計(jì) 算lncRNA SOX21-AS1的相對表達(dá)水平。

1.3.2 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、OVCR3和人卵巢正常上皮細(xì)胞HOSE均采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%的青鏈霉素，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)qPCR結(jié)果挑選出高表達(dá)lncRNA SOX21-AS1的細(xì)胞株用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%~60%時(shí)將其分為si-NC組和si-SOX21-AS1組。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取5 μg NC siRNA或lncRNA SOX21-AS1 siRNA加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，加入5 μL LipofectamineTM2000混勻后室溫孵育5 min，分別加入各組SKOV3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，通過qPCR檢測干擾效果。

1.3.3 MTS實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力將si-NC組和si-SOX21-AS1組細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞、100 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24 h、48 h及72 h時(shí)，在96孔板的培養(yǎng)基中加入20 μL/孔MTS試劑。常規(guī)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的A值。將si-NC組和si-SOX21-AS1組細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔500個(gè)細(xì)胞、2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。14 d后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次后，甲醇固定細(xì)胞10 min并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力將si-NC組和si-SOX21-AS1組單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞、100 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基接種于Transwell小室的上室中，下室中加入500 μL添加10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12 h后，棄掉培養(yǎng)基，棉簽擦去上室面殘余細(xì)胞，PBS洗3次，甲醇固定細(xì)胞10 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)各組穿過小室的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.5 TOP/FOP熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路活性 將si-NC組和si-SOX21-AS1組細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞、100 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將TOP-flash或FOP-flash熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測量各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將si-NC組和si-SOX21-AS1組細(xì)胞胰酶消化后PBS洗3次，采用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，14 000 r/min離心30 min提取細(xì)胞中蛋白。采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。吸取等量的蛋白質(zhì)，加至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳以分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在室溫下與封閉液孵育1 h。TBST洗3次，PVDF膜 與Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、cMyc、MMP-7和GAPDH一抗稀釋液（均1∶300稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗3次后，PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測蛋白條帶，Quantity One 4.6.6軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)卵巢癌組織lncRNA SOX21-AS1的相對表達(dá)水平為（1.67±0.32），高于癌旁組織（0.96±0.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=75，t=16.747，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征的卵巢癌患者lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平比較不同年齡分層、組織分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移間lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平升高（P＜0.01），見表1。

2.3 不同卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)水平比較lncRNA SOX21-AS1在人卵巢正常上皮細(xì)胞HOSE和卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780、OVCR3中的相 對表 達(dá) 水 平 分 別 為0.86±0.07和7.60±1.36、3.63±0.64、5.48±0.73，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=35.081，P＜0.05），與卵巢正常上皮細(xì)胞相比，卵巢癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的相對表達(dá)水平均升高，在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的相對表達(dá)水平最高，選用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab.1 Comparison of relative expression levels of lncRNA SOX21-AS1 between ovarian cancer patients with different clinical features表1不同臨床特征的卵巢癌患者lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平比較

2.4 lncRNA SOX21-AS1 siRNA干擾效果與si-NC組相比，si-SOX21-AS1組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表2。

2.5 2 組細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力比較與si-NC組相比，48 h、72 h時(shí)的si-SOX21-AS1組卵巢癌細(xì) 胞SKOV3增殖能力和SKOV3克隆團(tuán)形成數(shù)降低（P＜0.05），si-SOX21-AS1組卵巢癌細(xì)胞SKOV3轉(zhuǎn)移能力和熒光素酶活性降低（P＜0.05），見表2、圖1。

2.6 2 組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較與si-NC組相比，si-SOX21-AS1組細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin、CyclinD1、cMyc和MMP-7蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），見表3、圖2。

Tab.2 Comparison of lncRNA SOX21-AS1 expression,proliferation,transfer and Wnt/β-catenin signaling pathway activity between two groups of cells表2 2組細(xì)胞lncRNA SOX21-AS1表達(dá)、增殖、轉(zhuǎn)移和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of lncRNA SOX21-AS1 expression,proliferation,transfer and Wnt/β-catenin signaling pathway activity between two groups of cells表2 2組細(xì)胞lncRNA SOX21-AS1表達(dá)、增殖、轉(zhuǎn)移和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別si-NC組si-SOX21-AS1組t lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)量0.98±0.02 0.38±0.07 14.275＊＊SKOV3增殖能力（A490）24 h 0.55±0.05 0.47±0.04 2.164 48 h 0.81±0.05 0.52±0.03 8.614＊＊72 h 1.30±0.07 0.73±0.04 12.246＊＊克隆團(tuán)形成數(shù)（個(gè)/視野）70.67±6.81 51.33±4.32 4.154＊細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目（個(gè)/視野）92.33±12.54 50.67±8.56 4.752＊TOP/FOP熒光素酶活性0.97±0.03 0.54±0.08 8.717＊＊

Fig.1 The effect of interfering the expression of lncRNA SOX21-AS1 on the proliferation and metastasis of ovarian cancer cells圖1干擾lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway related protein expression between the two groups of cells表3 2組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway related protein expression between the two groups of cells表3 2組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別si-NC組si-SOX21-AS1組t Wnt3a 0.91±0.06 0.36±0.05 12.197＊＊β-catenin 0.47±0.03 0.31±0.02 7.686＊CyclinD1 0.52±0.06 0.11±0.03 10.586＊＊cMyc 1.18±0.14 0.19±0.02 12.125＊＊MMP-7 0.98±0.10 0.27±0.02 12.059＊＊

Fig.2 Effects of interfering lncRNA SOX21-AS1 on the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins in ovarian cancer cells圖2干擾lncRNA SOX21-AS1對卵巢癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

3 討論

卵巢癌早期癥狀具有隱匿性，僅有15%的臨床早期卵巢癌被診斷出來，目前有效的治療方法為早期手術(shù)切除，但大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期且發(fā)生轉(zhuǎn)移。由于該病缺乏有效的治療手段，導(dǎo)致患者預(yù)后差和病死率高［9-10］。分子靶向治療是具有廣泛應(yīng)用前景的抗腫瘤治療手段，在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等腫瘤中均已得到應(yīng)用［11-12］。目前，抗血管內(nèi)皮生長因子和多聚ADP-核糖聚合酶抑制劑等分子靶向藥物與化療聯(lián)合應(yīng)用方案在卵巢癌治療中取得了一定的療效［13］。因此，探索卵巢癌惡性進(jìn)展的潛在分子機(jī)制，將可能為卵巢癌的治療提供新的干預(yù)分子靶點(diǎn)。

lncRNA SOX21-AS1是 位于染 色體13q32.1上的lncRNA，可轉(zhuǎn)錄為2 986個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本［14］。在阿爾茨海默病中，lncRNA SOX21-AS1可上調(diào)FZD3/5表達(dá)、激活Wnt信號通路、減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡［15］。另有研究表明，lncRNA SOX21-AS1在包括肝癌和腎母細(xì)胞瘤等人類腫瘤中發(fā)揮了致癌作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，提示lncRNASOX21-AS1可能是卵巢癌的分子標(biāo)志物。lncRNA SOX21-AS1在許多腫瘤中與患者臨床病理因素有關(guān)。Zhang等［5］發(fā)現(xiàn)，lncRNA SOX21-AS1高表達(dá)與FIGO分期Ⅱb-Ⅲa、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤深度≥2/3有關(guān)。lncRNA SOX21-AS1在腎母細(xì)胞瘤中高表達(dá)與腫瘤體積大、國家威爾姆斯腫瘤研究（NWTS）分期晚期關(guān)系密切［17］。本研究結(jié)果顯示，與FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比，F(xiàn)IGO分期Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者lncRNA SOX21-AS1相對表達(dá)水平升高，提示lncRNA SOX21-AS1可能促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。

另外，本研究結(jié)果顯示，lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與人體組織水平檢測結(jié)果一致，再次證實(shí)抑制lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌中發(fā)揮了癌基因的作用。相關(guān)研究亦證實(shí)，lncRNA SOX21-AS1在骨肉瘤中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和侵襲［18］。lncRNA SOX21-AS1可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲［7］。然而，lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。既往研究顯示，lncRNA SOX21-AS1可通過激活PI3K/AKT信號通路活性、抑制Hippo信號通路活性，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展［6，19］。lncRNA SOX21-AS1/miR-144-3p/PAK7軸通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路活性，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［7］。Wnt/βcatenin信號通路在胚胎發(fā)育過程中是必不可少的，其異常激活在包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及多藥耐藥性中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［7］。本研究結(jié)果顯示，干擾lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路活性降低，提示lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)與Wnt/β-catenin信號通路的活性關(guān)系密切。Wnt/βcatenin通路通常在Wnt配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合后被激活，進(jìn)而促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活包括CyclinD1、cMYC和MMPs在內(nèi)的多種下游蛋白質(zhì)和基因［20］。本研究結(jié)果顯示，干擾lncRNA SOX21-AS1的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、cMyc和MMP7蛋白表達(dá)水平均降低，提示lncRNA SOX21-AS1可能通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路活性，從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。

綜上所述，lncRNA SOX21-AS1在卵巢癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，這與FIGO高分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的活性，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。lncRNA SOX21-AS1具有作為抗卵巢癌治療分子靶點(diǎn)的潛力。