唑來膦酸鹽通過p38 MAPK信號通路調控高糖微環(huán)境下成骨細胞分化

侯甜，秦雅芝，張妍，溫國琛，張嘯，董偉

糖尿病性骨質疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）發(fā)病機制涉及糖基化終末產物增加及成骨細胞活性降低等［1］。高葡萄糖環(huán)境對成骨細胞增殖和分化的抑制作用可能是多種機制相互作用的結果［2］。唑來膦酸鹽（zoledronate，ZOL）是臨床使用中最有效和最長效的雙膦酸鹽（biphosphonates，BPs）類藥物之一，可治療原發(fā)性或繼發(fā)性骨質疏松癥［3］。然而，目前關于ZOL在高糖微環(huán)境下對成骨細胞分化的確切作用機制還需進一步明確。研究顯示，ZOL能促進小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的骨鈣素表達，調節(jié)成骨細胞的分化［4］。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated kinase，p38 MAPK）信號途徑是參與成骨細胞分化的關鍵途徑之一，可調節(jié)復雜的細胞程序［5］。在骨骼生成過程中，Wnt信號通路在各類細胞的成骨機制中同樣發(fā)揮著關鍵作用［6］。本研究旨在探討高糖微環(huán)境下ZOL在MC3T3-E1細胞分化過程中的影響及p38 MAPK通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料細胞MC3T3-E1購于中國科學院上海細胞生物所。p38 MAPK通路抑制劑SB203580購于Selleck公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、鬼筆環(huán)肽、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液均購于Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購于BI公司；BCA試劑盒、胰酶、碘化丙啶（PI）染色液、二甲基亞砜（DMSO）均購于Beyotime公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購于北京索萊寶科技有限公司；茜素紅染色液購于北京雷根生物技術有限公司；兔抗小鼠p38 MAPK一抗、p-p38 MAPK一抗購于Cell Signaling公司；兔抗小鼠Wnt5a一抗購于SCBT公司；兔抗小鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）一抗購于GeneTex公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）一抗購于Affinity公司；兔抗小鼠GAPDH、異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)的山羊抗鼠二抗、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽（TRITC）偶聯(lián)的山羊抗兔二抗均購于Proteintech公司；羊抗兔二抗購于KPL公司。CO2培養(yǎng)箱購于上海博訊實業(yè)有限公司，熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司，超凈工作臺購于青島海爾公司，全自動酶標儀購于上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司。

1.2研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組將凍存的MC3T3-E1細胞在37℃水浴箱中復蘇，復蘇后的細胞培養(yǎng)在含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，隔天換液，當密度達80%~90%時，用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。依處理方法的不同，將MC3T3-E1細胞分為低糖（LG）組、LG+ZOL組、高糖（HG）組、HG+ZOL組。在Western blot實 驗 中 加 入 第5組：HG+ZOL+SB203580組。SB203580濃度為10 μmol/L，LG、HG分別為5.5 mmol/L和16.5 mmol/L的葡萄糖，ZOL為0.1 μmol/L。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力將MC3T3-E1細胞消化完成后調整密度為4 000個/孔，將細胞懸液移至96孔板，每孔滴加100 μL細胞懸液。待細胞完全貼壁伸展后棄掉原培養(yǎng)基，按1.2.1實驗分組對MC3T3-E1細胞進行處理。培養(yǎng)至24、48、72 h時，吸去上清液，PBS洗滌2遍，加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，分別加入DMSO 150 μL/孔，震蕩15 min，使藍紫色結晶溶解。使用酶標儀在490 nm波長處測定細胞的吸光度（A）值。

1.2.3 細胞骨架熒光染色在6孔板中提前放置好細胞爬片，取生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞，將其消化為細胞懸液，細胞以2×104個/孔的密度接種在6孔板中，每孔滴加細胞懸液為1 mL。待細胞完全貼壁伸展后按1.2.1分組對MC3T3-E1細胞進行處理。24 h后棄去孔板內液體，PBS洗2遍，用4%多聚甲醛固定細胞，0.5%Triton X-100透化10 min，PBS再次洗滌，向孔板內加入200 μL濃度為100 nmol/L的鬼筆環(huán)肽染液，覆蓋細胞爬片，避光孵育3 h，隨后用PI染液復染核5 min。熒光顯微鏡下采集照片并觀察細胞骨架，用Image J軟件分析細胞數目。

1.2.4 ALP活性定量檢測將MC3T3-E1細胞消化完成后收集細胞懸液，以1×104個/孔的細胞密度轉移至24孔板，每孔滴入500 μL細胞懸液。待細胞完全貼壁伸展后，按1.2.1分組處理，同時各組添加成骨誘導液連續(xù)誘導7 d，隔天換液。檢測過程按試劑盒說明書中的操作步驟進行，于520 nm波長處檢測孔板內細胞的A值，根據說明書計算ALP活性。

1.2.5 茜素紅染色檢測礦化結節(jié)生成情況將MC3T3-E1細胞消化完成后按1×104個/孔的接種密度將細胞懸液轉移至24孔板，每孔滴入500 μL細胞懸液。待細胞完全貼壁伸展后，按1.2.1分組處理，各組添加成骨誘導液連續(xù)誘導21 d，隔天換液，95%乙醇固定細胞30 min，茜素紅染液對結節(jié)染色5 min。Image J軟件分析茜素紅染色陽性區(qū)域占總區(qū)域的百分比表示礦化結節(jié)生成情況。

1.2.6 免疫熒光法檢測MC3T3-E1細胞的Wnt5a、p38 MAPK表達在6孔板內放置好細胞爬片，將MC3T3-E1細胞消化完成后，以4×104個/孔的密度接種，向6孔板中的爬片上滴加1 mL細胞懸液。待細胞完全貼壁伸展后按1.2.1分組更換培養(yǎng)基。24 h后棄去培養(yǎng)基，爬片上滴加4%多聚甲醛后固定30 min，10%山羊血清封閉30 min，棄液后向孔板內各組爬片滴加抗體Wnt5a（1∶50）、p38 MAPK（1∶50），4℃孵育過夜。第2天向孔內爬片加入FITC、TRITC標記的二抗，37℃條件下孵育2 h，DAPI染核2 min。熒光顯微鏡下觀察各組Wnt5a、p38 MAPK的表達，Image J軟件分析各組細胞的平均熒光表達強度。

1.2.7 Western blot檢測Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達MC3T3-E1細胞懸液移至6孔板中。按1.2.1分組更換培養(yǎng)基并添加成骨誘導液連續(xù)誘導7 d，隔天換液。用預冷的PBS沖洗后，裂解液提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒測蛋白濃度，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉到PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗Wnt5a（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、BMP2（1∶500）、COLⅠ（1∶500）、GAPDH（1∶2 000），放入4℃冰箱內過夜。第2天加入羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃條件下孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液顯影，數字成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，Image J軟件分析其灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MC3T3-E1細胞在不同時間點增殖水平的比較在細胞培養(yǎng)24、48、72 h后，LG組、LG+ZOL組、HG組、HG+ZOL組MC3T3-E1細胞增殖活性差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖1。

Fig.1 The proliferation levels of cells detected by MTT assay at different time points圖1 MTT法檢測不同時間點細胞的增殖水平

2.2 各組MC3T3-E1細胞骨架清晰程度及細胞數量比較染色結果顯示，與LG組相比，LG+ZOL組細胞骨架更為清晰，細胞數目增多，HG組細胞微絲排列紊亂，細胞內部結構不甚清晰且細胞數目少（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組細胞骨架清晰程度有所提升，細胞內部構造更為清晰，細胞伸展良好且數目增多（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組MC3T3-E1細胞ALP活性比較與LG組相比，LG+ZOL組ALP活性升高，HG組ALP活性降低（P＜0.05）；HG+ZOL組ALP活性較HG組升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組MC3T3-E1細胞礦化結節(jié)結果比較與LG組相比，LG+ZOL組礦化結節(jié)形成大而多，HG組礦化結節(jié)量少（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組礦化結節(jié)增多（P＜0.05）。見圖4。

Fig.2 The cell cytoskeleton clarity of cells detected by phalloidin staining圖2鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞骨架的清晰度及細胞數量

Fig.3 Comparison of the ALP activity between the four groups of cells圖3各組細胞ALP活性的比較

2.5 各組MC3T3-E1細胞Wnt5a、p38 MAPK表達結果 比 較與LG組 相 比，LG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達強度明顯增加，HG組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達強度明顯下降（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達強度增加（P＜0.05），見圖5。

2.6 各組MC3T3-E1細胞中Wnt5a、p38 MAPK、pp38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達水平的比較Western blot結果顯示，與LG組相比，LG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達明顯增加，HG組上述蛋白表達明顯下降（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組上述蛋白表達增加（P＜0.05）；HG+ZOL+SB203580組MC3T3-E1細胞中上述蛋白表達與HG+ZOL組相比明顯減少（P＜0.05），見表1、圖6。

Fig.4 The generation of mineralized nodules of cells detected by alizarin red staining圖4茜素紅染色法檢測細胞的礦化結節(jié)的生成

3 討論

3.1 高糖抑制MC3T3-E1細胞成骨分化目前，DOP的發(fā)病率不斷上升，其骨折風險隨著病程和血糖控制不佳而增加［7-8］。DOP的病因機制是多方面的，目前尚不清楚其確切的發(fā)病機制。COLⅠ被認為是一種重要的結構蛋白，與成骨分化密切相關［9］。有研究指出，高糖狀態(tài)下糖基化終末產物的形成可減少COLⅠ的形成并抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化［10］。Doherty等［11］認為，高糖狀態(tài)下會使得骨膜細胞的增殖能力以及成骨活性降低，導致骨形成減少，骨骼愈合能力嚴重受損。此外，MC3T3-E1細胞骨架除維持形態(tài)外，還可積極參與細胞的增殖、分化過程，進而影響骨形成［12］。本研究結果顯示，相較于LG組，HG組細胞的骨架清晰度、ALP活性、礦化結節(jié)生成情況及成骨標志物BMP2、COLⅠ蛋白表達水平均有所下降。以上結果表明，在高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細胞成骨分化能力被減弱。

3.2 低濃度ZOL促進高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細胞成骨分化BPs是DOP患者的一線治療藥物［13］。目前，ZOL的相關報道多關于破骨細胞，其可有效抑制破骨細胞的分化，進而抑制骨吸收［14-15］。同時，有研究指出ZOL濃度對于間充質干細胞有著雙重作用，低濃度促進其成骨分化，高濃度則抑制［16］。而國內外關于低濃度ZOL對MC3T3-E1細胞的成骨分化調節(jié)作用以及在高糖微環(huán)境下的相關機制仍未明確。在本研究中選用0.1 μmol/L ZOL對MC3T3-E1細胞進行干預，結果顯示LG+ZOL組較LG組，HG+ZOL組較HG組的細胞骨架清晰度、ALP活性、礦化結節(jié)生成情況及成骨相關蛋白BMP2、COLⅠ蛋白表達水平均顯著升高。由此提示低濃度的ZOL對MC3T3-E1細胞成骨分化有促進作用，同時可有效改善高糖微環(huán)境下對其成骨分化的抑制。

3.3 ZOL通過p38 MAPK信號途徑影響高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細胞的成骨分化作為MAPK家族中的一個重要成員，p38 MAPK信號途徑參與了不同細胞中各種細胞因子的成骨調節(jié)過程［17］。除了MAPK，Wnt家族在成骨方面也發(fā)揮著關鍵作用。Wnt5a是Wnt蛋白家族非經典途徑中最具代表性的蛋白，其可通過Wnt/平面細胞極性或Wnt/Ca2+途徑來實現其功能［18］。研究表明，靶向干預Wnt5a可能是改善代謝性骨骼疾?。ㄈ绻琴|疏松癥）的可行策略［19］。因此，Wnt5a及其相關信號通路可能是骨相關疾病治療的重要作用靶點。但是，在高糖微環(huán)境下ZOL對于MC3T3-E1細胞成骨分化的確切機制尚有待闡明。本研究在Western blot實驗中增加了HG+ZOL+SB203580組。實驗結果顯示，HG+ZOL+SB203580組Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達水平相比于HG+ZOL組下降，進一步提示p38 MAPK通路可能參與了調節(jié)高糖微環(huán)境下ZOL對MC3T3-E1細胞的成骨分化過程。而Wnt5a蛋白的變化進一步提示p38 MAPK通路和Wnt途徑可能共同參與介導了MC3T3-E1細胞的成骨分化過程。

Fig.5 The fluorescence expression intensity of Wnt5a and p38 MAPK detected by immunofluorescence staining圖5免疫熒光染色檢測Wnt5a和p38 MAPK的熒光表達強度

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1細胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達 （n=3，±s）

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1細胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與LG組比較，b與LG+ZOL組比較，c與HG組比較，d與HG+ZOL組比較，P＜0.05。

組別LG組LG+ZOL組HG組HG+ZOL組HG+ZOL+SB203580組F Wnt5a 1.00±0.00 1.33±0.08a 0.64±0.09ab 1.10±0.11bc 0.54±0.06abd 53.354＊＊p38 MAPK 1.00±0.00 1.38±0.18a 0.57±0.08ab 0.88±0.05bc 0.52±0.10abd 35.789＊＊p-p38 MAPK 1.00±0.00 1.81±0.25a 0.49±0.09ab 0.85±0.08bc 0.43±0.07abd 56.242＊＊BMP2 1.00±0.00 1.21±0.07a 0.64±0.05ab 1.14±0.09ac 0.35±0.05abcd 110.142＊＊COLⅠ1.00±0.00 1.25±0.08a 0.81±0.06ab 1.05±0.07bc 0.70±0.07abd 34.826＊＊

Fig.6 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells圖6細胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達

綜上所述，高糖可抑制MC3T3-E1細胞成骨分化，在加入低濃度ZOL后可改善高糖的抑制作用，這可能與抑制p38 MAPK通路有關。同時，可考慮靶向干預Wnt5a，進而通過p38 MAPK通路和Wnt途徑的聯(lián)合作用來調節(jié)MC3T3-E1細胞的成骨分化過程，可為藥物治療DOP提供一定的理論依據，詳細機制仍需要進一步研究。