犀角地黃湯合方對DC激活ITP患者T細胞增殖分化的影響

楊武霞，劉寶山，吳玉紅，李潤杰，王夢曉，王愛迪△

免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是以無明確誘因的孤立性外周血血小板減少為主要特點的一種常見的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為不同程度的出血，輕者可見皮膚黏膜出血，嚴重者可見內(nèi)臟及顱內(nèi)出血［1］。體液免疫失調(diào)和細胞免疫失調(diào)為ITP的主要發(fā)病機制。細胞免疫失調(diào)主要指T細胞功能異常，包括調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）數(shù)量減少和效應性T細胞（effector T cells，Teff）數(shù)量增多等。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）作為功能強大的抗原提呈細胞，在受到抗原刺激后可逐漸成熟，進而激活T細胞，使初始T細胞增殖活化并分化為Treg和Teff，引起免疫功能紊亂，導致ITP的發(fā)生［2］。本研究旨在通過DC荷載血小板抗原與CD4+T細胞共培養(yǎng)，體外模擬ITP發(fā)病過程中T細胞被DC激活的情況，探討犀角地黃湯合方對DC激活的T細胞增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)于易生源基因科技（天津）有限公司動物中心清潔級動物房，溫度20～26℃。適應性喂養(yǎng)7 d，自由進食和飲水。

1.2 研究對象選取2021年9月—2022年1月于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科住院的初診ITP患者8例，年齡18～50歲，診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療專家共識》（2016年版），且不伴有妊娠、糖尿病、高血壓、結核病和其他（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強直性脊柱炎等）自身免疫性疾??；同期選取天津醫(yī)科大學總醫(yī)院健康志愿者15例，年齡18～50歲，排除妊娠、高血壓、糖尿病、結核病和其他自身免疫性疾病，且肝腎功能及血常規(guī)均正常。本研究符合醫(yī)學倫理要求并通過天津醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會審核批準（IRB2020-KY-189），所有入選者均對研究知情同意。

1.3 主要試劑與儀器犀角地黃湯合方顆粒劑購自天津紅日康仁堂藥業(yè)，人全血單個核細胞分離液購自天津瀚洋生物制品有限責任公司，CD14免疫磁珠購自德國美天旎生物技術有限公司，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）、重組人白細胞介素（IL）-4及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）均購自北京索萊寶生物工程有限公司，脂多糖（LPS）購自德國默克公司，PD-1抗體、CD4抗體、CD25抗體、叉頭框蛋白P3（FoxP3）抗體購自BD Bioscience公司；白細胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自北京索萊寶生物工程有限公司。Transwell小室購自美國康寧公司、CO2細胞培養(yǎng)箱Micro CL21R、常溫低速離心機、Presco 21Muitifuge XIR離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，超凈工作臺購自蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司，Cytation 3型多功能酶標儀購自美國Bio-Tek公司，流式細胞儀（FCM）購自安捷倫科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 犀角地黃湯合方含藥血清制備采用隨機數(shù)字表法將10只SD大鼠分為含藥血清組和空白血清組，每組5只。犀角地黃湯合方成人臨床常用量為水牛角30 g（先煎）、生地24 g、白芍12 g、丹皮9 g、當歸6 g、黃芪30 g、旱蓮草15 g及女貞子15 g，根據(jù)《中藥藥理研究方法學》［3］按人與動物體表面積換算公式等效計量法確定大鼠用量為2 g/（kg·d），濃縮藥物含量至2 g/mL，4℃冰箱保存。給藥方法：含藥血清組給予犀角地黃湯合方灌胃，空白血清組給予等量蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃3 d。末次給藥1 h后腹主動脈取血，靜置2 h后700×g離心10 min取上層血清，除菌滅活后放置于-20℃冰箱，備用。

1.4.2 CD14+T細胞和CD4+T細胞獲取收取ITP患者和健康志愿者外周血50 mL，將血液等濃度稀釋后緩慢加入到人單個核細胞分離液上層，700×g離心20 min，液體分為4層，吸取第2層環(huán)狀乳白色層，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后得到外周血單個核細胞，計數(shù)，每1×107個細胞加入20 μL CD14+免疫磁珠，4℃孵育15 min后將細胞懸液通過磁力架上的細胞分選柱，得到CD14+T細胞。同樣的方法收集得到CD4+T細胞。

1.4.3 荷載血小板抗原的DC細胞培養(yǎng)將ITP患者自體血小板與CD14+T細胞以數(shù)量100∶1的比例加入到含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基中重懸，并加入終濃度為5×104ng/L的IL-4及1×105ng/L的GM-CSF，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，再加入1×103μg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導成為荷載血小板抗原的成熟DC細胞。

1.4.4 CFSE標記CD4+T細胞在進行共培養(yǎng)檢測T細胞增殖能力前，將CD4+T先進行CFSE染色，用PBS調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，并加入2×CFSE工作液，輕輕混勻。37℃避光孵育10 min，加入10 mL 37℃預熱的完全培養(yǎng)基，室溫顛倒混勻，終止標記反應。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，再加入5 mL全培養(yǎng)基洗滌1次后與荷載血小板抗原的DC細胞構建共培養(yǎng)體系。

1.4.5 建立DC與CD4+T細胞共培養(yǎng)體系并分組干預將荷載血小板抗原的DC與CD4+T細胞按照數(shù)量1∶10的比例培養(yǎng)于Transwell小室，DC接種于下室（1×105個/孔），CD4+T細胞接種于上室（1×106個/孔）。將共培養(yǎng)細胞分為對照組、模型組和犀角地黃湯合方低、中、高劑量組，對照組為荷載血小板抗原的DC與健康志愿者CD4+T細胞，模型組和犀角地黃湯合方低、中、高劑量組為荷載血小板抗原的DC與ITP患者的CD4+T細胞，其中對照組和模型組加入大鼠空白血清，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組分別加入體積分數(shù)5%、10%、20%大鼠含藥血清，干預72 h。

1.4.6 FCM檢測經(jīng)CFSE標記的CD4+T細胞的增殖情況干預結束后，收集各組上室中的CD4+T細胞，并調(diào)整為6×105個/mL，PBS洗滌2次，流式細胞儀FL1通道檢測CD4+T細胞增殖情況。

1.4.7 FCM檢測CD4+T細胞中Treg和Teff的比例干預結束后，收集各組上室中的CD4+T細胞，并調(diào)整為6×105個/mL，PBS洗 滌2次，以CD4+CD25+FoxP3+標 記Treg細 胞，CD4+CD25-標記Teff，常溫避光反應20 min后PBS洗滌2次，流式細胞術檢測CD4+T細胞中CD4+CD25+FoxP3+及CD4+CD25-表達率。

1.4.8 FCM檢測CD4+T表面PD-1表達量干預結束后，收集各組上室中的CD4+T細胞，并調(diào)整細胞濃度為6×105個/mL，PBS洗滌2次，加入PD-1抗體，常溫避光反應20 min后PBS洗滌2次，流式細胞術檢測PD-1的表達量。

1.4.9 ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中細胞因子的含量 干預完成后，收集共培養(yǎng)細胞上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-10、TGF-β的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，多組間用單因素方差分析，方差齊者用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，方差不齊用Welch法，多重比較用Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下DC和CD4+T細胞形態(tài)人外周血單個核細胞誘導的DC細胞培養(yǎng)到第7天時細胞成熟，大部分細胞懸浮生長，倒置顯微鏡下可見細胞邊緣有明顯的樹突樣突起；從外周血中分離出的CD4+T細胞亦懸浮生長，鏡下可見細胞呈圓形，體積較小，見圖1。

2.2 各組CD4+T細胞增殖情況比較對照組、模型組及犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細胞增殖比例分別為（單位：%）84.34±0.63、94.34±0.24、88.24±0.34、87.27±0.60、86.05±0.58（n=3，F(xiàn)=172.709，P＜0.05）；與對照組比較，其他各組CD4+T淋巴細胞增殖比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T淋巴細胞增殖比例依次降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組CD4+T細胞中Treg和Teff比例比較與對照組比較，各組Treg比例降低，Teff比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組Treg細胞比例升高，Teff比例依次降低（P＜0.05），見圖3、表1。

2.4 各組CD4+T細胞表面PD-1表達量比較對照組、模型組及犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細胞PD-1的表達量分別為（單位：%）：9.03±0.45、4.83±0.60、5.35±0.94、5.94±0.48、8.37±0.18（n=3，F(xiàn)=1 616.023，P＜0.05），與對照組比較，各組CD4+T細胞上PD-1的表達量減少（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細胞上PD-1表達量依次升高（P＜0.05），見圖4。

Fig.1 DC and CD4+T cells and co-culture morphology of DC and CD4+T cells under inverted microscope圖1倒置顯微鏡下DC、CD4+T細胞及DC與CD4+T細胞共培養(yǎng)形態(tài)

Fig.2 Effects of XJDHHF on DC-induced CD4+T cell proliferation圖2 DC誘導后各組CD4+T細胞增殖的水平

Fig.3 The proportion of Treg and Teff in CD4+T cells in each group圖3各組CD4+T細胞中Treg、Teff的比例

Tab.1 The proportion of Treg and Teff cells in CD4+T cells in each group表1各組細胞中Treg和Teff細胞所占CD4+T細胞的比例（n=3，%，±s）

Tab.1 The proportion of Treg and Teff cells in CD4+T cells in each group表1各組細胞中Treg和Teff細胞所占CD4+T細胞的比例（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量比較，d與中劑量比較，P＜0.05。

組別對照組模型組犀角地黃湯合方低劑量組犀角地黃湯合方中劑量組犀角地黃湯合方高劑量組F Treg 8.82±0.11 3.46±1.11a 4.09±0.13ab 5.23±0.95abc 6.47±0.45abc 747.550＊＊Teff 67.75±1.20 82.54±0.66a 79.50±0.69ab 76.57±0.97abc 72.02±1.70abcd 83.971＊＊

2.5 各組CD4+T細胞下游效應因子分泌水平比較與對照組比較，各組的促炎因子IL-2、IFN-γ、IL-17水平升高，抑炎因子IL-10、TGF-β水平降低，但高劑量組IFN-γ和IL-10與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組促炎因子IL-2水平降低，抑炎因子IL-10、TGF-β水平升高（P＜0.05）；低、中、高劑量組IFN-γ、IL-17依次降低，但低劑量組IFN-γ、IL-17與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義；TGF-β水平依次升高（P＜0.05），見表2。

3 討論

目前，ITP的一線治療方案包括輸注糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白、血小板生成素（TPO）受體激動劑、脾切除術及免疫抑制劑等［4］。盡管這些治療方案在短期內(nèi)對ITP具有一定效果，但其不良反應較大，長期緩解率較低。ITP在傳統(tǒng)醫(yī)學中被稱為“紫癜病”［5］。根據(jù)其“熱”、“虛”、“瘀”的病因病機，劉寶山教授采用“益氣養(yǎng)陰、涼血化瘀”的治療法則，擬定以犀角地黃湯（水牛角代、生地黃、白芍、丹皮）為主方，加用當歸補血湯（當歸、黃芪）和二至丸（女貞子、旱蓮草）治療本病，臨床效果顯著［6］。

Fig.4 Expression levels of PD-1 on CD4+T cells in each group圖4各組CD4+T細胞表面PD-1表達量

Tab.2 The amount of downstream effectors secreted by CD4+T cells in each group表2各組CD4+T細胞下游效應因子分泌的量 （n=3，ng/L，±s）

Tab.2 The amount of downstream effectors secreted by CD4+T cells in each group表2各組CD4+T細胞下游效應因子分泌的量 （n=3，ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與犀角地黃湯合方低劑量比較，d與犀角地黃湯合方中劑量比較，P＜0.05。

組別對照組模型組犀角地黃湯合方低劑量組犀角地黃湯合方中劑量組犀角地黃湯合方高劑量組F IL-2 15.77±3.46 137.56±7.19a 51.71±3.30ab 27.98±0.51abc 27.52±1.53abc 476.357＊＊150.24±10.71 809.56±41.18a 685.93±7.45a 467.41±21.54abc 381.29±56.48bcd 915.451＊＊IFN-γ IL-17 118.80±3.27 520.29±9.96a 515.86±3.51a 456.48±5.25abc 327.08±6.59abcd 2 226.488＊＊IL-10 47.22±2.54 16.45±3.70a 27.76±3.05ab 31.81±2.43ab 41.54±4.39bc 39.683＊＊TGF-β 609.51±9.39 200.84±3.69a 213.98±1.91ab 311.57±3.60abc 481.23±7.04abcd 2 810.404＊＊

既往觀點認為，ITP的發(fā)病機制主要是體液免疫失調(diào)導致的血小板過度破壞和血小板生成受抑。近年來，越來越多的研究聚焦于細胞免疫失調(diào)，其中CD4+T細胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)在ITP的病理生理過程中發(fā)揮重要作用［7］。CD4+T細胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)表現(xiàn)為Treg數(shù)量和功能下降，以及Teff過度活化、增殖能力增強［8］。T細胞的激活需要DC參與并提供3種信號：第一信號是外源性抗原肽與DC表面主要組織相容性復合體（MHC）分子結合形成的MHC分子-抗原肽復合物，與T細胞表面受體（TCR）相互作用；第二信號是DC表面表達的協(xié)同共刺激分子CD80、CD86和人類白細胞DR抗原（HLA-DR）等與T細胞表面分子如CD28相互作用后產(chǎn)生共刺激信號；第三信號是DC分泌產(chǎn)生的細胞因子如IL-12、TNF-α、IL-6等，直接影響T細胞的分化方向。CD4+T細胞被DC激活后可以增殖分化為Treg細胞和Teff細胞［9-10］。Treg和Teff是初始T細胞被激活后增殖分化的兩種功能不同的T細胞亞群，其中Treg細胞是限制免疫和確保免疫耐受的重要檢查點，可通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子促進CD4+T細胞不斷分化，或通過細胞間接觸抑制效應性免疫細胞的活化和增殖，發(fā)揮免疫負調(diào)控作用，從而維持機體的免疫平衡［11］。Teff細胞是執(zhí)行免疫功能的主要細胞，當Teff細胞分泌的炎性因子IL-2、IFN-γ、IL-17等過多時，可導致自身免疫或過敏性疾病的發(fā)生［12］。

本課題前期研究證實，犀角地黃湯合方可以修復Teff/Treg失衡，這可能與抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路活化有關［6］。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組CD4+T增殖比例明顯增加，Treg比例明顯降低，Teff比例明顯升高，且促炎因子IL-2、IL-17、IFN-γ水平較高，抑炎因子TGF-β、IL-10水平較低，表明血小板預載活化的DC細胞可以激活ITP患者CD4+T細胞過度增殖，導致ITP細胞模型發(fā)生過度免疫反應。經(jīng)犀角地黃湯合方含藥血清干預后，與模型組比較，犀角地黃湯合方低中高劑量組CD4+T增殖比例下降，且Treg比例上升，Teff比例下降，IL-2、IL-17、IFN-γ等促炎因子水平下降，抑炎因子TGF-β和IL-10水平上升，提示犀角地黃湯合方含藥血清尤其是高劑量組可在體外抑制CD4+T的過度增殖，糾正ITP患者Teff和Treg的比例失衡，調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。

PD-1是一種共抑制性表面受體，可影響T細胞的分化，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，促進Treg細胞生成，在免疫應答調(diào)控、免疫耐受的建立中發(fā)揮重要作用。PD-1主要通過與其配體PD-L1結合，促使TCR復合物中的信號分子去磷酸化，抑制TCR信號傳導，進一步抑制T細胞增殖活化、并抑制炎性細胞因子分泌［13］。本研究顯示，與對照組比較，模型組PD-1的表達量明顯減少，提示ITP患者細胞模型存在免疫功能失調(diào)，經(jīng)犀角地黃湯合方含藥血清干預后，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組PD-1表達量依次升高，提示犀角地黃湯合方尤其是高劑量組可以提高T細胞表面PD-1的表達，抑制TCR信號的傳導，進而影響T細胞的增殖分化。

綜述所述，犀角地黃湯合方含藥血清可以在體外提高CD4+T細胞表面PD-1的表達，抑制T細胞的過度增殖活化，進而影響T細胞的分化，促進Treg細胞的生成，抑制Teff細胞的生成，使促炎因子IL-2、IL-17、IFN-γ分泌減少，抑炎因子TGF-β、IL-10分泌增多。有利于機體恢復免疫平衡穩(wěn)態(tài)，對ITP產(chǎn)生積極作用。