注射用舒尼鉑(凍干粉)的制劑安全性初步研究*

徐紅花，廖偉，劉瑞，楊坤芬，廖文平

(1.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111)

鉑類(lèi)抗癌藥物在臨床用于惡性腫瘤的化療，其中順鉑和卡鉑是目前臨床上廣泛使用的抗癌藥物，也是治療許多腫瘤的首選藥物[1-2];據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前40%～80%的腫瘤患者都接受了含有鉑類(lèi)藥物的化療[3-4].已上市的鉑類(lèi)抗癌藥物均為2價(jià)鉑的化合物，因其在消化道的化學(xué)環(huán)境下穩(wěn)定性較差，易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而降解，口服給藥無(wú)抗癌作用[5]，故臨床上一般用靜脈給藥制劑.

注射用舒尼鉑(凍干粉)為昆明貴金屬研究所、中科院上海藥物研究所和云南白藥集團(tuán)共同研發(fā)的一種新型鉑類(lèi)抗癌候選藥物，其原料藥也是2價(jià)鉑類(lèi)化合物，是以舒鉑為先導(dǎo)化合物經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾而來(lái)，同時(shí)組合了卡鉑的部分結(jié)構(gòu).前期藥學(xué)研究表明，注射用舒尼鉑(凍干粉)的水溶性和溶液的穩(wěn)定性好，對(duì)胃癌和肺癌人腫瘤裸小鼠皮下移植瘤療效顯著，因此有望作為注射劑開(kāi)發(fā)為治療胃癌和肺癌的新型鉑類(lèi)抗腫瘤藥物.

研究通過(guò)局部毒性、免疫原性(過(guò)敏性)和異常毒性試驗(yàn)，考察注射用舒尼鉑(凍干粉)作為靜脈注射給藥的制劑安全性，為1.1類(lèi)新藥申報(bào)提供安全性依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

注射用舒尼鉑：凍干粉，云南省藥物研究所中試基地產(chǎn)品，規(guī)格：50 mg/瓶，以舒尼鉑原料藥計(jì).陰性對(duì)照為氯化鈉注射液(0.9%)；溶媒為葡萄糖注射液(5%)，昆明南疆制藥有限公司產(chǎn)品.陽(yáng)性對(duì)照為卵清白蛋白，Sigma公司產(chǎn)品；白蛋白(雞蛋)，SIGMA-ALORICH公司產(chǎn)品.

1.2 儀器

Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為美國(guó)BECKMAN COULTER公司產(chǎn)品；Thermo 1500全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystems公司產(chǎn)品；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；TC-30K電子天平為美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；MSS-4S動(dòng)物麻醉機(jī)為上海任誼生物科技有限公司產(chǎn)品；0-150 mm電子開(kāi)關(guān)數(shù)顯卡尺為桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司產(chǎn)品.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

溶血試驗(yàn)采用普通級(jí)新西蘭家兔，邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0005.血管刺激性試驗(yàn)采用SD大鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006；異常毒性試驗(yàn)采用SPF級(jí)KM種小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011；主動(dòng)全身過(guò)敏性試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)采用SPF級(jí)Hartley豚鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，均來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司.動(dòng)物使用福利倫理審查機(jī)構(gòu)和編號(hào)：云南省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)，動(dòng)(倫)IACUC-2017-52(溶血試驗(yàn))、動(dòng)(倫)IACUC-2018-25(大鼠重復(fù)毒性試驗(yàn))、動(dòng)(倫)IACUC 2018-04(異常毒性)、動(dòng)(倫)IACUC-2018-16(主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn))和動(dòng)(倫)IACUC-2018-21(被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)).

1.4 試驗(yàn)方法[6-9]

1.4.1 溶血試驗(yàn)(體外)

家兔耳中央動(dòng)脈采血，去除纖維蛋白原，用氯化鈉注射液制備2.0%紅細(xì)胞懸液，按表1依次加入藥品、紅細(xì)胞懸液、陰性和陽(yáng)性對(duì)照品，在(37±0.5)℃溫箱中溫育3 h，溫育結(jié)束，肉眼觀(guān)察各試驗(yàn)管的溶血反應(yīng)，并取上清液0.1 mL于545 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算溶血率(%).溫育后紅細(xì)胞全部下沉，上清液為無(wú)色澄明，且溶血率<5%，表明無(wú)溶血發(fā)生；否則為溶血或紅細(xì)胞凝聚.

表1 溶血試驗(yàn)加樣表Table 1 Table of sample addition for hemolysis test

1.4.2 血管刺激性試驗(yàn)

整合到大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中觀(guān)察，將動(dòng)物分為溶媒對(duì)照組、注射用舒尼鉑(凍干粉)3.0、6.0 mg/mL和12.0 mg/mL濃度組，每組32只動(dòng)物，雌雄各半，每3 d尾靜脈注射給藥1次，共12次，每次給藥容積為9.0 mL·kg-1，末次給藥后恢復(fù)6 w，每天肉眼觀(guān)察動(dòng)物給藥局部的刺激反應(yīng)情況.

1.4.3 異常毒性試驗(yàn)

將10只動(dòng)物分為注射用舒尼鉑(凍干粉)低劑量組(190.0 mg/kg)和高劑量組(286.0 mg/kg)，每組5只，3雌2雄，各組以每只動(dòng)物0.5 mL的給藥體積，勻速并在4～5 s內(nèi)完成尾靜脈注射.48 h內(nèi)每天稱(chēng)重1次,觀(guān)察動(dòng)物一般體征2次；觀(guān)察結(jié)束后解剖動(dòng)物，觀(guān)察各臟器、器官的體積、顏色和質(zhì)地等情況.若48 h內(nèi)動(dòng)物無(wú)異常反應(yīng)和死亡，判定為符合規(guī)定.

1.4.4 主動(dòng)全身過(guò)敏性試驗(yàn)

將40只動(dòng)物分為陰性對(duì)照組(5%葡萄糖注射液)，陽(yáng)性對(duì)照組(10.0 mg/mL卵清白蛋白)，注射用舒尼鉑(凍干粉)低、中、高劑量組(3.0、6.0 mg/mL和12.0 mg/mL)，每組8只，雌雄各半.以每只動(dòng)物0.5 mL的體積腹腔注射致敏3次，隔日1次，末次致敏后第14和21天每組分別取4只(雌雄各2只)動(dòng)物按每只1.0 mL靜脈注射激發(fā).激發(fā)后觀(guān)察3 h內(nèi)動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，并根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)癥狀進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)，過(guò)敏反應(yīng)癥狀評(píng)分和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2.

表2 全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for evaluation of systemic sensitization

1.4.5 被動(dòng)皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)

制備抗體血清階段：將10只動(dòng)物分為5組，每組2只，雌雄各半，組別和給藥劑量同1.4.4內(nèi)容，陽(yáng)性對(duì)照組給予10.0 mg/mL的白蛋白(雞蛋)，共給藥5次，隔日1次.末次給藥第10天采血，分離血清冷凍保存.

被動(dòng)致敏及激發(fā)階段：另取30只動(dòng)物分為5組，組別同制備抗體血清階段，每組6只，雌雄各半.將制備的不同稀釋度抗體血清皮內(nèi)注射于對(duì)應(yīng)組動(dòng)物背部(左上、左下、右上、右下分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)致敏，4 h后一次快速靜脈注射對(duì)應(yīng)濃度藥液與0.5%伊文思藍(lán)按1∶1的混合液1.0 mL激發(fā).30 min后犧牲動(dòng)物，測(cè)量皮膚內(nèi)層的藍(lán)斑大小，當(dāng)藍(lán)斑直徑大于5 mm判為陽(yáng)性.

2 結(jié)果

2.1 溶血試驗(yàn)

溫育180 min后肉眼觀(guān)察，陽(yáng)性對(duì)照管溶液不分層，均為紅色澄明液體；注射用舒尼鉑(凍干粉)各管與陰性對(duì)照管比較無(wú)明顯肉眼差異，上清液均為澄明無(wú)色，下層為紅色，均無(wú)凝聚；各管溶血率<5%.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 注射用舒尼鉑(凍干粉)溶血性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the hemolytic test of suniplatin injection(lyophilized powder)

-表示管中溶液上層澄明無(wú)色，下層紅色，無(wú)凝聚；+表示管中溶液紅色澄明，無(wú)凝聚.

2.2 血管刺激性試驗(yàn)

3.0 mg/mL 濃度組動(dòng)物未見(jiàn)異常，6.0 mg/mL和12.0 mg/mL濃度組部分動(dòng)物尾部中下段在第3次給藥后開(kāi)始逐漸出現(xiàn)脫屑、皮膚隆起、滲出液和結(jié)痂的刺激反應(yīng)癥狀，停藥2～3 d可逐漸恢復(fù).

2.3 異常毒性試驗(yàn)

低、高劑量組動(dòng)物給藥后48 h內(nèi)觀(guān)察無(wú)異常體征和動(dòng)物死亡；給藥后第1天低、高劑量組大部分動(dòng)物體重略下降，給藥后第2天恢復(fù)增長(zhǎng)；觀(guān)察結(jié)束后解剖各臟器未見(jiàn)異常.動(dòng)物體重變化情況見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 雌鼠體重變化情況 圖2 雄鼠體重變化情況Fig.1 Changes in the weight of female mice Fig.2 Changes in the weight of male mice

2.4 主動(dòng)全身過(guò)敏性試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組全部動(dòng)物在第14和21天激發(fā)后，均出現(xiàn)不同程度的痙攣和潮式呼吸、步態(tài)不穩(wěn)、搔鼻、排尿、豎毛、喘息、不安寧和跳躍的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，4 min內(nèi)全部動(dòng)物死亡，全身致敏性評(píng)價(jià)為過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性，陰性和注射用舒尼鉑(凍干粉)各劑量組動(dòng)物未見(jiàn)任何過(guò)敏反應(yīng)癥狀發(fā)生，全身致敏性評(píng)價(jià)為陰性.結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 激發(fā)給藥后過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分及分級(jí)結(jié)果Table 4 The results of anaphylaxis score and grading after challenge administration

2.5 被動(dòng)皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物背部各血清稀釋度皮膚內(nèi)層的藍(lán)斑直徑均大于5 mm，皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)為陽(yáng)性.陰性對(duì)照組和注射用舒尼鉑(凍干粉)各劑量組背部皮膚內(nèi)層均未見(jiàn)藍(lán)斑，皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)均為陰性(結(jié)果見(jiàn)表5).

表5 藍(lán)斑直徑Table 5 Diameter of locus coeruleus

3 討論

藥物凍干工藝對(duì)臨床用藥具有十分重要的意義，與液體劑型相比，凍干粉具有易于長(zhǎng)期運(yùn)輸保存，確保無(wú)菌無(wú)熱源，能夠進(jìn)行水分重新吸收，利于恢復(fù)藥物活性等優(yōu)點(diǎn)，這也是凍干粉針劑得到廣泛應(yīng)用的原因[10-11]，但凍干粉針劑作為無(wú)菌藥品的常用劑型，采用非最終滅菌的無(wú)菌生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)過(guò)程仍存在多因素的影響，相對(duì)于其他劑型屬于高風(fēng)險(xiǎn)劑型[12].因此，注射用舒尼鉑(凍干粉)作為1.1類(lèi)新藥開(kāi)發(fā)，在非臨床研究的初期開(kāi)展全面的制劑安全性評(píng)價(jià)研究非常重要.

研究結(jié)果顯示，注射用舒尼鉑(凍干粉)在最大溶解濃度12.0 mg/mL及以下不會(huì)引起家兔體外紅細(xì)胞溶血，靜脈注射對(duì)小鼠無(wú)異常毒性反應(yīng)，也不會(huì)引起豚鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，而整合到大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中的血管刺激性試驗(yàn)，觀(guān)察到注射部位(尾部)及周?chē)忻撔肌⑵つw隆起、滲出液和結(jié)痂的刺激癥狀，表明注射用舒尼鉑(凍干粉)在6.0 mg/mL及以上濃度多次給藥會(huì)產(chǎn)生血管刺激性，但試驗(yàn)中未進(jìn)行刺激性評(píng)分和組織病理學(xué)檢查，而組織病理學(xué)檢查又是血管刺激性試驗(yàn)結(jié)果判斷的主要依據(jù)[13-14]，故認(rèn)為以上結(jié)果不足以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)注射用舒尼鉑(凍干粉)的血管刺激性.下一步將采用家兔開(kāi)展血管刺激性試驗(yàn)，依據(jù)血管刺激性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).