紫草素對(duì)鼻咽癌CNE1細(xì)胞免疫逃逸的影響

王祥香， 吳李仲， 吳祥基

（瓊海市人民醫(yī)院耳鼻喉科，海南瓊海 571400）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是指原發(fā)于鼻咽黏膜被覆上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首，患者臨床主要表現(xiàn)為回縮性血涕、鼻出血等，隨著疾病發(fā)展可累及聽(tīng)力受損和吞咽障礙等[1]。鼻咽癌屬于中醫(yī)學(xué)“鼻淵”“鼻疽”“鼻衄”“石上疽”等范疇，肺熱痰火及肝膽熱毒上擾為鼻咽癌發(fā)病的主要病機(jī)[2]。近年來(lái)，從中草藥中提取有效的活性成分逐步成為化療藥物研究的熱點(diǎn)。紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內(nèi)蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等病證。紫草素（shikonin）是從紫草中提取的小分子萘醌類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多重藥理作用[3]。已有研究表明，紫草素具有顯著抗鼻咽癌的作用[4-6]，并能改善腫瘤細(xì)胞耐藥[7-8]，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。腫瘤免疫逃逸是腫瘤形成的關(guān)鍵，也是腫瘤免疫治療的重要突破口[9]。因此，本研究擬通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察紫草素對(duì)鼻咽癌免疫逃逸的影響，進(jìn)一步探討紫草素的抗鼻咽癌作用，以期為臨床治療鼻咽癌提供參考依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)人鼻咽癌CNE1細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)菌種保存中心（ATCC）。CNE1細(xì)胞以含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換培養(yǎng)液，生長(zhǎng)到90%時(shí)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物、試劑與儀器紫草素（分子式：C16H16O5；分子量：288.3；純度＞99%），美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：S7576；紫杉醇（純度≥98%），云南漢德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：cp110302。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；兔抗GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；兔抗程序性死亡受體1配體（PD-L1）抗體、兔抗叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）抗體、兔抗維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）抗體（美國(guó)BD Pharmingen公司）；山羊抗兔IgG（武漢純度生物科技公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技公司）。流式細(xì)胞儀（天津眾立生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（上海豫光儀器公司）；凝膠成像系統(tǒng)及Western Blot電泳系統(tǒng)（北京賽百奧科技公司）；SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀（北京普凱瑞生物科技有限公司）。

1.3體外研究

1.3.1 紫草素配制 紫草素溶解于1%二甲基亞砜（DMSO），配制成64 μmol/L溶液，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.3.2 分組與干預(yù) 人鼻咽癌CNE1細(xì)胞重懸后，以1.5×106個(gè)/mL接種于96孔板中，分為陰性對(duì)照組，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組。陰性對(duì)照組CNE1細(xì)胞不進(jìn)行干預(yù)；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組CNE1細(xì)胞分別給予對(duì)應(yīng)濃度紫草素共同培養(yǎng)；紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細(xì)胞與2.5 μmol/L的紫杉醇共同培養(yǎng)。均處理24 h。

1.3.3 MTT法測(cè)定CNE1細(xì)胞活性 將CNE1細(xì)胞密度調(diào)成5×103個(gè)/mL，接種于6孔板中培養(yǎng)，按“1.4”項(xiàng)進(jìn)行分組與干預(yù)，24、48、72、96 h后，按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，最后應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD）值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.4 Hoechst法檢測(cè)CNE1細(xì)胞凋亡情況 將CNE1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，按“1.4”項(xiàng)進(jìn)行分組與干預(yù)。用40 g/L的多聚甲醛溶液固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入5 mg/L Hoechst熒光材料染色，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈高亮藍(lán)色熒光，未凋亡細(xì)胞呈低強(qiáng)度熒光。隨機(jī)拍照選擇5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用ImageJ 1.47i軟件分析平均熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)CNE1細(xì)胞Foxp3、RORγt蛋白表達(dá) 將CNE1細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/mL，按“1.4”項(xiàng)進(jìn)行分組與干預(yù)。裂解、離心取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，上樣、電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，先后與一抗二抗反應(yīng)[Foxp3（1∶600稀釋?zhuān)?、RORγt（1∶1 000稀釋?zhuān)┖蛢?nèi)參GAPDH（1∶2 000稀釋?zhuān)┑纫豢?℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋?zhuān)┏胤跤? h]，加入電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，曝光，最后應(yīng)用JY-Clear系統(tǒng)分析各蛋白灰度值，結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示。

1.4體內(nèi)研究

1.4.1 鼻咽癌裸鼠模型建立 取對(duì)數(shù)分裂期CNE1細(xì)胞備用。取48只健康雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18~22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行。參考文獻(xiàn)方法[5]建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型：無(wú)菌環(huán)境下于裸鼠側(cè)背部皮下注射1.0×107個(gè)/mL單CNE1細(xì)胞懸液，10 d后出現(xiàn)綠豆大小的腫瘤塊。接種21 d時(shí)腫瘤體積在100 mm3以上表示建模成功。

1.4.2 裸鼠分組及干預(yù)方法 建模成功后，將鼻咽癌模型裸鼠分為模型組，紫草素低、中、高劑量組和紫杉醇組，另設(shè)正常組，每組8只。紫草素低、中、高劑量組裸鼠分別灌胃1.0、2.0、3.0 mg/kg紫草素，紫杉醇組裸鼠腹腔注射2.0 mg/kg紫杉醇，正常組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液。每日1次，連續(xù)7 d。

1.4.3 巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng) 末次干預(yù)后頸部脫臼法處死裸鼠，75%乙醇消毒后放入超凈工作臺(tái)中用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液腹腔灌洗3次。收集灌洗液以10 000 r/min（離心半徑12 cm）離心10 min，收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。重懸細(xì)胞后接種于6孔板中，放入5%CO237℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)，2 h后棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，再次加入含有10%PBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞吹打后以2 000 r/min離心（離心半徑10 cm）。用PBS重懸細(xì)胞，加入PD-L1抗體，5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）結(jié)合物與5 μL碘化丙啶（PI）混合后染色，避光條件下，孵育15 min后注入400 μL結(jié)合緩沖液混勻。洗滌3次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。應(yīng)用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.5 瘤體質(zhì)量及抑瘤率 頸部脫臼處死裸鼠，剝離瘤體并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組腫瘤質(zhì)量-治療組腫瘤質(zhì)量）/模型組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.4.6 Western Blot法檢測(cè)Foxp3、RORγt蛋白表達(dá) 取正常組鼻黏膜組織及其他各組腫瘤組織，關(guān)鍵檢測(cè)步驟同“1.3.5”項(xiàng)。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組CNE1細(xì)胞活性比較表1結(jié)果顯示：干預(yù)24、48、72、96 h時(shí)，與陰性對(duì)照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細(xì)胞活性均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明，紫草素可以抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞增殖。

表1 各組CNE1細(xì)胞活性比較Table 1 Comparison of CNE1 cell activity among various groups

2.2各組CNE1細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組的CNE1細(xì)胞凋亡率分別為（2.25±0.15）%、（12.14±0.30）%、（18.50±1.20）%、（24.55±2.25）%及（26.33±2.47）%，多組間比較存在差異（F=228.400，P＜0.001）。與陰性對(duì)照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組間細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L組細(xì)胞凋亡率與紫杉醇2.5 μmol/L組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖1所示，Hoechst染色凋亡細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，呈現(xiàn)分葉、碎片狀，表明紫草素可以促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤作用。

圖1 Hoechst法檢測(cè)各組CNE1細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 1 Results of the Hoechst method for detecting apoptosis of CNE1 cells in various groups

2.3各組CNE1細(xì)胞Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較表2結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組 及 紫 杉 醇2.5 μmol/L組CNE1細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)水平升高、RORγt蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L組組Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平與紫杉醇2.5 μmol/L比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 各組CNE1細(xì)胞Foxp3、RORγt蛋白電泳圖Figure 2 Electropherogram of Foxp3 and RORγt proteins in various groups of CNE1 cells

表2 各組CNE1細(xì)胞Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of CNE1 cells

2.4各組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)比較正常組、模型組、紫草素低劑量組、紫草素中劑量組、紫草素高劑量組及紫杉醇組PD-L1在裸鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)的陽(yáng)性率分別為（4.50±0.26）%、（55.82±2.50）%、（39.86±2.11）%、（30.43±1.80）%、（18.93±1.37）%及（17.24±1.05）%，多組間比較存在顯著性差異（F=118.000，P＜0.001）。與陰性對(duì)照組比較，模型組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平比較，存在顯著性差異（P＜0.05）；紫草素高劑量組PD-L1表達(dá)水平與紫杉醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組裸鼠巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3所示。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)結(jié)果Figure 3 Flow cytometry results of PD-L1 expression in macrophages in various groups of nude mice

2.5各組裸鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較表3結(jié)果顯示：與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠瘤體質(zhì)量均降低，抑瘤率升高（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較存在差異（P＜0.05）；紫草素高劑量組瘤體質(zhì)量及抑瘤率與紫杉醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組裸鼠移植瘤大體形態(tài)如圖4所示。

圖4 各組裸鼠移植瘤大體形態(tài)Figure 4 Gross morphology of transplanted tumours in various groups of nude mice

表3 各組裸鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

表3 各組裸鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與紫草素低劑量組比較；③P＜0.05，與紫草素中劑量組比較

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2.6各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較表4結(jié)果顯示：與正常組鼻黏膜組織比較，模型組裸鼠腫瘤組織Foxp3蛋白表達(dá)水平降低、RORγt蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠腫瘤組織Foxp3蛋白表達(dá)水平升高、RORγt蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫草素高劑量組Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平與紫杉醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白電泳圖Figure 5 Protein electropherogram of Foxp3 and RORγt in various groups of nude mice

表4 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

表4 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與紫草素低劑量組比較；④P＜0.05，與紫草素中劑量組比較

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3 討論

腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和快速發(fā)展的主要原因。大量腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞構(gòu)成了免疫抑制的微環(huán)境，在腫瘤逃逸機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。有研究[10]證實(shí)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)程序性死亡受體1配體（PD-L1）后腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)。PD-L1屬于B7家族的細(xì)胞表面糖蛋白，高表達(dá)PD-L1的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要通過(guò)與CD8+T淋巴細(xì)胞上的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖、存活，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞活性的作用，并介導(dǎo)其發(fā)生凋亡，導(dǎo)致殺傷腫瘤的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，削弱免疫系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)[11]，但PD-L1+巨噬細(xì)胞在鼻咽癌進(jìn)展過(guò)程中的作用尚未明確。本研究通過(guò)建立荷鼻咽癌CNE1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，采用不同濃度的紫草素干預(yù)后提取巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示：紫草素可以下調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，減小瘤體體積，表明紫草素可抑制巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。

輔助性T細(xì)胞17（Th17）與T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs）均為CD4+T細(xì)胞亞群之一，通過(guò)分化與功能的相互拮抗，共同維持機(jī)體免疫功能的相對(duì)穩(wěn)定。RORγt是對(duì)Th17細(xì)胞的分化起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，若抑制RORγt的表達(dá)，則可抑制未致敏T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[12]。研究表明，由炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中也存在RORγt表達(dá)激活[13]。Foxp3被認(rèn)為是Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和特異性標(biāo)記物，它可通過(guò)與染色體結(jié)合后，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)和功能，進(jìn)而控制Treg細(xì)胞的發(fā)育[14]。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)oxp3降低可促進(jìn)免疫逃逸[15]。研究表明，鼻咽癌細(xì)胞Foxp3活性下降，干預(yù)后Foxp3表達(dá)升高而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[16]。轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3決定細(xì)胞受抗原刺激后是向Th17細(xì)胞分化還是向Treg細(xì)胞分化的情況，兩者的平衡或紊亂決定了機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞或鼻咽癌裸鼠中均存在Foxp3表達(dá)降低、RORγt表達(dá)升高，采用紫草素干預(yù)后腫瘤細(xì)胞Foxp3表達(dá)升高，RORγt表達(dá)降低，表明紫草素可以上調(diào)鼻咽癌Foxp3水平、下調(diào)RORγt水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中Treg主導(dǎo)的免疫耐受現(xiàn)象。

綜上所述，紫草素可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，抑制瘤體生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與其降低腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的PD-L1活性，激活腫瘤細(xì)胞Foxp3并抑制RORγt表達(dá)，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞免疫逃逸有關(guān)。