沒食子酸對急性呼吸衰竭大鼠的治療作用及機(jī)制

張春梅， 胡利容， 鄭建偉， 胡小紅

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院合江醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川瀘州 646200；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川瀘州 646200；3.合江縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川合江 646200）

急性呼吸衰竭（acute respiratory failure）是由于中樞系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)原發(fā)或繼發(fā)性病變，引起通氣或換氣功能障礙，致使呼吸系統(tǒng)吸入O2和排出CO2功能因不能滿足機(jī)體的代謝需要而導(dǎo)致呼吸不暢的危重臨床綜合征[1]。隨著中醫(yī)急癥搶救水平的日益提高，中醫(yī)藥也逐漸參與了呼吸衰竭的搶救治療，成為研究熱點(diǎn)。沒食子酸作為中藥材五倍子、石榴、掌葉大黃等的主要成分之一，是化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡單的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理學(xué)作用[2]。既往研究[3-4]表明，沒食子酸可改善大鼠放射性肺損傷、膿毒癥大鼠急性肺損傷，起到肺保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步探討沒食子酸治療急性呼吸衰竭大鼠的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用沒食子酸改善肺損傷提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物取40只SPF級健康成年雌雄參半的SD大鼠，6~8周齡，體質(zhì)量180~300 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物學(xué)部提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2020-0015。本實(shí)驗(yàn)在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室完成。整個實(shí)驗(yàn)過程按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行。

1.2藥物、試劑與儀器沒食子酸（分子式：C7H6O5，分子量：170.12，純度＞99%，成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：16022801）；硫酸阿托品注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H31021171，規(guī)格：1 mL∶1 mg）。白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-17酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國eBioscience公司）；超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）ELISA試劑盒（上海心語生物科技有限公司）；兔抗大鼠磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）抗體、Smad3抗體、Smad7抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。動物肺功能檢測儀（長沙百禾儀器設(shè)備有限公司）；血?dú)夥治鰞x（四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司）；JZ100張力換能器（高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司）。

1.3分組、建模與給藥將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、阿托品組、沒食子酸組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)研究[5]建立急性呼吸衰竭模型。方法：將大鼠麻醉后固定在操作臺上，進(jìn)行支氣管插管，支氣管滴入5 mg/kg大腸桿菌脂多糖。造模結(jié)束后，依據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果，若動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）＜35 mmHg、動脈血氧分壓（PaO2）＜75 mmHg，則判斷建模成功[5]。建模成功后，沒食子酸組大鼠給予沒食子酸溶液20 mg/kg灌胃[6]，阿托品組大鼠腹腔注射0.1 mL硫酸阿托品注射液，正常組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，干預(yù)7 d。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 呼吸功能監(jiān)測與血?dú)夥治?應(yīng)用動物肺功能檢測儀器記錄大鼠呼吸頻率，血?dú)夥治鰞x檢測酸堿度（pH）、PaO2、PaCO2。

1.4.2 ELISA法檢測血清IL-8、IL-17、hs-CRP水平 按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀于500 nm波長處檢測光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值計(jì)算IL-8、IL-17、hs-CRP的含量。

1.4.3 離體膈肌張力測定 脫頸處死大鼠，取出膈肌條，清理表層肌肉組織，放入盛滿37℃Kreb’s液并連續(xù)輸入95%CO2和5%CO2混合氣體的麥?zhǔn)显〔壑?。將一端固定在浴槽底部，另一端連接張力換能器并固定在微調(diào)器上，調(diào)節(jié)膈肌條至適宜長度（L0）。穩(wěn)定放置20 min后，把2個鉑金絲電極放置于肋條兩邊，將電子刺激器設(shè)置參數(shù)為電壓20 V刺激膈肌條。應(yīng)用Medlab-U/4c生物信號采集處理系統(tǒng)測量膈肌張力參數(shù)顫搐收縮張力（Pt）、強(qiáng)直顫搐收縮張力（P0）、疲勞指數(shù)（FI）。

1.4.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理變化 脫頸處死大鼠，取肺組織固定，脫水、石蠟包埋，制作厚度為5 μm的切片，-20℃保存。脫蠟后，蒸餾水沖洗，蘇木素染色15 min，流水沖洗，乙醇水化，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，封片，顯微鏡觀察。

1.4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）法檢測肺組織p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表達(dá) 取肺組織，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液于冰上裂解后，離心取上清液測蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液按5∶1混勻，沸水浴5 min。配制10%~15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離膠和5%的濃縮膠。上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色。加入5%脫脂奶粉置于搖床上30 r/min振蕩封閉1 h，再分別加入兔抗大鼠一抗稀釋液p-ERK（1∶5 000）、Smad3（1∶7 500）、Smad7（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000），4℃振蕩孵育過夜。次日，TBST洗滌，加入羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗稀釋液（1∶2 000），室溫振蕩孵育1 h，TBST洗滌后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。以β-actin為內(nèi)參。采用IPP 6.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2降低（P＜0.05）；與模型組比較，沒食子酸組和阿托品組大鼠呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2均升高（P＜0.05）；與阿托品組比較，沒食子酸組呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠呼吸頻率、pH值、PaCO2、PaO2比較Table1 Comparison of respiratory rate，pH，PaCO2 and PaO2 among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠呼吸頻率、pH值、PaCO2、PaO2比較Table1 Comparison of respiratory rate，pH，PaCO2 and PaO2 among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿托品組比較

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2.2各組大鼠血清中IL-8、IL-17及hs-CRP水平比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血 清 中IL-8、IL-17及hs-CRP水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，沒食子酸組和阿托品組IL-8、IL-17及hs-CRP水平均降低（P＜0.05）；與阿托品組比較，沒食子酸組IL-8、IL-17及hs-CRP水平降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-17、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平比較Table 2 Comparison of serum IL-8，IL-17 and Hs-CRP levels among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-17、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平比較Table 2 Comparison of serum IL-8，IL-17 and Hs-CRP levels among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿托品組比較

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2.3各組大鼠膈肌收縮功能的比較表3結(jié)果顯示：模型組大鼠膈肌Pt、P0、FI值均低于正常組；與模型組比較，沒食子酸組和阿托品組大鼠膈肌Pt、P0、FI值升高（P＜0.05）；與阿托品組比較，沒食子酸組膈肌Pt、P0、FI值升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠膈肌顫搐收縮張力（Pt）、強(qiáng)直顫搐收縮張力（P0）、疲勞指數(shù)（FI）比較Table 3 Comparison of diaphragm function Pt，P0 and FI among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠膈肌顫搐收縮張力（Pt）、強(qiáng)直顫搐收縮張力（P0）、疲勞指數(shù)（FI）比較Table 3 Comparison of diaphragm function Pt，P0 and FI among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿托品組比較

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2.4各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較圖1結(jié)果顯示：正常組肺泡完整且大小均勻，肺泡腔內(nèi)干凈，肺泡間隔保持一致，無增厚現(xiàn)象；模型組肺泡毛細(xì)血管壁有明顯充血現(xiàn)象，肺泡間隔增厚并伴有水腫和炎癥細(xì)胞浸潤；阿托品組肺泡腔有少量充血，肺泡間隔不同程度增厚，有部分炎癥細(xì)胞浸潤，少量肺泡血腫；與模型組比較，沒食子酸組肺泡內(nèi)壁清潔度升高，肺泡間隔變薄，毛細(xì)血管充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤減輕，且肺組織改善情況優(yōu)于阿托品組。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of histopathological changes in lung tissues among various groups of rats（by HE staining，100）

2.5各組大鼠肺組織中p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較表4、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織p-ERK、Smad3蛋白表達(dá)水平升高，Smad7蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，沒食子酸組和阿托品組大鼠肺組織中p-ERK、Smad3蛋白表達(dá)水平降低，Smad7蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與阿托品組比較，沒食子酸組肺組織中p-ERK、Smad3蛋白表達(dá)水平更低，Smad7蛋白表達(dá)水平更高（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠肺組織磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of p-ERK，Smad3 and Smad7 in lung tissues among various groups of rats

圖2 各組大鼠肺組織磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）、Smad3、Smad7的Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blotting electrophoretic bands of p-ERK，Smad3 and Smad7 in lung tissues in various groups of rats

3 討論

急性呼吸衰竭時，pH值、PaCO2、PaO2等血?dú)夥治鲋笜?biāo)會明顯異常。檢測血?dú)夥治鲋笜?biāo)pH值、PaCO2、PaO2水平，可對急性呼吸衰竭癥狀嚴(yán)重程度以及臨床治療效果進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評價[7]。本研究結(jié)果顯示，急性呼吸衰竭模型組大鼠呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2值較正常組明顯降低，而沒食子酸組大鼠呼吸頻率及pH值、PaCO2、PaO2值較模型組明顯上升，表明沒食子酸可改善急性呼吸衰竭大鼠肺通氣與換氣功能和酸堿失衡。

膈肌是主要的呼吸肌，膈肌的張力、耐力降低是發(fā)生膈肌疲勞、呼吸困難的主要原因[8-9]。急性呼吸衰竭時，因呼吸衰竭過程中肌纖維蛋白含量減少，收縮蛋白或細(xì)胞骨架蛋白的異常和興奮-收縮耦聯(lián)功能的障礙，膈肌收縮能力降低[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠膈肌顫搐收縮張力（Pt）、強(qiáng)直顫搐收縮張力（P0）、疲勞指數(shù)（FI）值均較正常組減弱，而沒食子酸組大鼠Pt、P0、FI值較模型組上升，且趨于正常組大鼠膈肌功能水平，結(jié)果表明，沒食子酸可抑制急性呼吸衰竭大鼠膈肌功能紊亂，緩解膈肌的疲勞程度，恢復(fù)膈肌耐力，調(diào)節(jié)膈肌的張力。

急性呼吸衰竭的發(fā)生伴隨著過度失控的炎癥反應(yīng)[11]。IL-8、IL-17、hs-CRP是廣譜的炎癥指標(biāo)[5]。IL-8主要來源于單核巨噬細(xì)胞，對中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化和激活作用，參與局部炎癥的形成[12]。IL-17是具有強(qiáng)大促炎作用的細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞分泌，IL-17能有效地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集和活化過程，從而引起組織的炎癥反應(yīng)[13]。hs-CRP是體內(nèi)最常見的急性時相反應(yīng)蛋白，作為炎癥反應(yīng)標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-8、IL-17、hs-CRP水平較正常組升高，而沒食子酸組大鼠血清IL-8、IL-17、hs-CRP水平較模型組明顯下降。病理結(jié)果還顯示，模型組肺泡毛細(xì)血管壁明顯充血，肺泡間隔增寬且有水腫和炎癥發(fā)生，經(jīng)沒食子酸干預(yù)治療后大鼠肺泡內(nèi)壁清潔度明顯升高。表明沒食子酸可減輕急性呼吸衰竭大鼠肺部急性炎癥反應(yīng)，保護(hù)肺功能。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是p38MAPK通路關(guān)鍵的信號物質(zhì)，包括ERK1和ERK2，是將信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵酶。磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)[15]。還有研究表明，特異性阻斷ERK后可以明顯降低各種原因引起的肺部損傷和炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織p-ERK蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高，表明急性呼吸衰竭ERK信號傳導(dǎo)通路在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平上被大量激活，在急性呼吸衰竭的發(fā)病機(jī)制過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)沒食子酸干預(yù)治療后的大鼠肺組織ERK蛋白磷酸化水平較模型組降低，表明沒食子酸可抑制急性呼吸衰竭大鼠肺組織ERK的活化，從而起到肺保護(hù)作用。

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β是急性肺損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。Smads是細(xì)胞內(nèi)重要的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，可以將TGF-β信號直接由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)。TGF-β1蛋白多種功能的發(fā)揮均依賴Smads蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控。最具有代表意義的是Smad3、Smad7，其中，Smad3是受體活化的Smads，對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著正向調(diào)節(jié)的作用，而Smad7則對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著負(fù)向調(diào)節(jié)的作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠肺組織p-ERK、Smad3蛋白水平較模型組升高，Smad7蛋白水平降低，而沒食子酸組大鼠肺組織p-ERK、Smad3蛋白水平較模型組降低，Smad7蛋白表達(dá)較模型組升高，表明食子可能通過調(diào)節(jié)p-ERK、Smad3、Smad7的信號表達(dá)，從而減輕肺損傷。

綜上所述，沒食子酸可改善急性呼吸衰竭大鼠癥狀，減輕肺損傷，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子釋放和調(diào)控肺組織p-ERK、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)有關(guān)。