基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究治療跌打損傷的用藥規(guī)律及其作用機(jī)制

鄒福賢，周曉蘭，溫秀萍

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬泉州市正骨醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350000)

唐代《外臺秘要》將損傷分為兩種，一者外損，一者內(nèi)傷；其中外損屬于中醫(yī)“傷筋”范疇，現(xiàn)代稱之為軟組織損傷，主要指人體關(guān)節(jié)周圍組織、肌肉遭受外來暴力撞擊、強(qiáng)力扭轉(zhuǎn)或牽拉等因素引起[1]。西醫(yī)治療軟組織損傷主要依靠一些抗炎藥，起到抗炎止痛的作用，但是其副作用比較明顯，如可能合成類固醇，影響人體正常激素水平。中醫(yī)在治療外損方面具有較多的相關(guān)文獻(xiàn)記載，雖然近年來也有部分學(xué)者對某一著作，如《跌打大全》[2]、《四部醫(yī)典》[3]、《中國藥典》[4]以及少數(shù)民族醫(yī)藥[5]等進(jìn)行跌打損傷用藥規(guī)律分析，這些研究對于各代名醫(yī)的傳承無疑具有重要意義，但是現(xiàn)有研究尚缺乏對歷代所有方劑中治療跌打損傷用藥規(guī)律的綜合研究，也尚未有對內(nèi)服藥和外用藥進(jìn)行比對的研究，并且關(guān)于軟組織損傷治療機(jī)制的研究也較少，有待深入挖掘?！吨嗅t(yī)方劑大辭典》是對所有從古至今名方的匯總，收方約10萬首，內(nèi)容全面，因此為深入分析古人治療跌打損傷的用藥規(guī)律，探討治療跌打損傷的新思路和方法，本研究采用古今醫(yī)案云平臺(V2.3.5)從中藥組成、中藥性味、歸經(jīng)、四氣五味等角度進(jìn)行統(tǒng)計分析、關(guān)聯(lián)分析、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，探究《中醫(yī)方劑大辭典》中治療外損的用藥規(guī)律，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明其作用機(jī)制，為臨床治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 資料與方法

1.1 資料來源與納入標(biāo)準(zhǔn)

以“軟組織”“跌損”“跌仆”“跌撲”“跌打”“閃跌”“傷損”“損傷”“撲損”“仆損”“打撲”“打仆”“傷筋”“挫傷”“挫閃”“閃挫”“扭傷”和“折傷”等為關(guān)鍵詞，對《中醫(yī)方劑大辭典》中所有方劑的功效主治進(jìn)行篩選，并將該方劑導(dǎo)入到跌打損傷數(shù)據(jù)庫。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①排除方劑的主治中包含上述關(guān)鍵詞，但并非治療跌打損傷的方劑，如五臟虛勞損傷、產(chǎn)前產(chǎn)后傷損、眼目傷損等；②排除僅有功效主治但無中藥組成的方劑；③排除藥物組成相同的方劑。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范化

參考《中國藥典(2020版)》和《中藥大辭典》中的藥材名，對部分異名進(jìn)行規(guī)范化訂正，如樸硝修改為芒硝、西黃改為牛黃、當(dāng)門子改為麝香等；其中難以考證者，保留其原名。采用雙人單獨(dú)數(shù)據(jù)規(guī)范化修訂，并比較兩人修訂的異同，然后進(jìn)一步修訂。

1.4 數(shù)據(jù)錄入和分析

將修訂后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入古今醫(yī)案云平臺中，通過數(shù)據(jù)挖掘模塊進(jìn)行藥物頻次統(tǒng)計、藥性分析、規(guī)則關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 處方納入情況

通過篩選，初步篩選出1 254首方劑，比對排除標(biāo)準(zhǔn)，逐一檢查后，剩余1 027首用于治療跌打損傷的方劑，其中涉及藥物976味。

2.2 處方出處分析

對1 027首方劑的出處進(jìn)行統(tǒng)計，所涉及古今醫(yī)書209本，主要來自明、宋、清三個時期編撰的醫(yī)學(xué)古籍。收載最多的為《普濟(jì)方》，《普濟(jì)方》全書有6萬余首方劑，是我國現(xiàn)存最大的古代方書，其中跌打損傷相關(guān)方劑76首；《圣濟(jì)總錄》收載方劑近2萬首，為北宋時期搜方較多的醫(yī)學(xué)全書，其中跌打損傷相關(guān)方劑60首。見表1。

表1 跌打損傷方劑主要出處

2.3 處方劑型分析

跌打損傷為外傷，其治療方式主要有外用和內(nèi)服兩種，涉及用藥劑型主要有散劑、膏劑、湯劑、丹、丸劑、酒劑以及其他劑型，如酊劑、片劑和貼劑等。內(nèi)服藥占整個跌打損傷藥的61%，主要為散劑、湯劑和丹劑，而外用藥主要為膏劑和散劑。見表2。

表2 跌打損傷方劑劑型頻數(shù)

2.4 藥物頻次統(tǒng)計

對藥物頻次進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)近一半的方劑中都含有當(dāng)歸，其次超過1/3的方劑含有乳香和沒藥，其他藥物如白芷、川芎、甘草、赤芍、大黃、紅花、血竭等頻次均超過15%，見表3和圖1。內(nèi)服藥和外用藥之間的藥物頻次存在一定的差異，兩種治療方法中出現(xiàn)頻次均較高的有當(dāng)歸、乳香、沒藥、赤芍和白芷，其中內(nèi)服方劑中當(dāng)歸出現(xiàn)的頻次遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他藥物，而在外用方劑中的頻次略高于其他藥物，另外白芷在外用方劑中出現(xiàn)的頻次較內(nèi)服方劑有顯著提升。不同之處在于內(nèi)服方劑中還高頻率使用了甘草以及川芎、紅花、血竭、自然銅等活血化瘀藥物；而外用方劑則高頻率使用了大黃以及草烏、川烏、防風(fēng)、羌活等祛風(fēng)止痛藥物。

表3 跌打損傷內(nèi)服方劑和外用方劑藥物頻次

2.5 藥物四氣、五味統(tǒng)計

在所有的藥物組成中，四氣統(tǒng)計將大熱歸屬于熱，大寒、微寒均歸屬于寒，微溫歸屬于溫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫性藥和平性藥占絕大多數(shù)；在五味統(tǒng)計中，澀味歸屬于酸，淡味歸屬于甘，據(jù)此統(tǒng)計出辛、苦味藥物最多，而酸、咸味藥物最少。見表4。

圖1 跌打損傷方劑的藥物頻次

表4 跌打損傷方劑中所有藥物的四氣五味頻次

2.6 藥物性味歸經(jīng)統(tǒng)計

對所有藥物的歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)內(nèi)服藥和外用藥在歸經(jīng)上并無太大差異，所有藥物大多數(shù)入肝經(jīng)，其次為入脾經(jīng)和心經(jīng)。見表5。

表5 跌打損傷方劑中所有藥物的歸經(jīng)頻

2.7 藥物關(guān)聯(lián)度分析

對方劑中含有的藥物組合出現(xiàn)的頻次進(jìn)行分析，以發(fā)現(xiàn)藥物之間的關(guān)系。篩選出置信度(同時包含兩種藥的方劑在所有包含其中一種藥物的方劑中的占比)超過0.8的，其對應(yīng)的提升度均大于1，說明藥物之間正相關(guān)性越強(qiáng)。乳香-沒藥、乳香-血竭、沒藥-血竭、當(dāng)歸-赤芍、當(dāng)歸-川芎和當(dāng)歸-羌活藥對無論在內(nèi)服方劑還是在外用方劑中關(guān)聯(lián)性都非常高，在內(nèi)服方劑中，當(dāng)歸與紅花、桃仁、生地、肉桂的關(guān)聯(lián)性較高，而在外用方劑中當(dāng)歸還與獨(dú)活和續(xù)斷的關(guān)聯(lián)度較高，另一個較大的差異是外用方劑中川烏-草烏、荊芥-防風(fēng)常配伍使用，見表6、表7和圖2。因此內(nèi)服方劑核心藥組為當(dāng)歸、川芎、羌活、紅花、赤芍、生地、桃仁、肉桂、乳香、沒藥和血竭；外用方劑核心藥組為當(dāng)歸、川芎、羌活、赤芍、獨(dú)續(xù)斷、乳香、沒藥、血竭、川烏、草烏、荊芥和防風(fēng)。

表6 內(nèi)服方劑中藥物關(guān)聯(lián)性分析

表7 外用方劑中藥物關(guān)聯(lián)性分析

2.8 聚類分析

采用歐式距離法篩選前20個藥物進(jìn)行聚類分析，見圖3?？蓪?nèi)服方劑核心藥物組分為三類：第一類為當(dāng)歸；第二類為乳香、沒藥、血竭、自然銅和骨碎補(bǔ)等，剩余的甘草、大黃、蘇木、紅花等14中藥為第三類。外用方劑同樣可分為三類：第一類為血竭、乳香和沒藥；第二類為當(dāng)歸和白芷；第三類為木鱉子、白及、赤芍、肉桂和大黃等15味中藥。

2.9 內(nèi)服方劑作用機(jī)制分析

2.9.1 內(nèi)服方劑核心藥組-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TC-FMSP)獲取核心藥組的化學(xué)成分和相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。根據(jù)化學(xué)成分的藥動學(xué)參數(shù)按口服生物利用度OB≥30%且類藥性DL≥0.18為篩選有效成分的條件；然后檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫有效成分的作用靶點(diǎn)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。疾病的靶點(diǎn)在GeneCards數(shù)據(jù)庫和CTD數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“Soft Tissue Injury”進(jìn)行查找，并與有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)取交集。結(jié)果除血竭和肉桂外檢索到9味中藥中符合上述條件的共有137個有效成分，并獲取到65個作用靶點(diǎn)(其中43個成分未檢索到靶點(diǎn))。利用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“核心藥組-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”，見圖4。中藥中自由度較高的為沒藥、乳香、桃仁、紅花和羌活，當(dāng)歸和生地的自由度較低；有效成分的平均自由度為4.3，自由度超過2倍平均值的有效成分有21個，見表8；靶點(diǎn)的平均自由度為6.6，自由度超過2倍平均值的靶點(diǎn)分別為PTGS2、NOCA2、PGR、HSP90AA1、NR3C2和GABRA1。

注：橙色：內(nèi)服方劑；藍(lán)色：外用方劑；線上數(shù)值：共現(xiàn)度。

圖3 內(nèi)服方劑(A)及外用方劑(B)排名前20的藥物聚類

注：圓形代表中藥；菱形代表有效成分；“V”形代表靶點(diǎn)。

表8 內(nèi)服方劑核心藥組有效成分

2.9.2 GO富集分析和KEGG通路分析 將“2.9.1”項下獲取的靶點(diǎn)，應(yīng)用R語言軟件中的BiocManager包進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。以GO富集條目中的FDR<0.05為篩選顯著富集的GO條目條件，結(jié)果生物過程(BP)具有986條，細(xì)胞成分(CC)有40條，分子功能(MF)有103條，每個項目排名前10的條目，見圖5；其中BP包括對類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程(vascular process in circulatory system)和細(xì)胞對藥物的反應(yīng)(cellular response to drug)等；CC主要與突觸膜有關(guān)，如integral component of postsynaptic membrane、intrinsic component of postsynaptic membrane和integral component of synaptic membrane等；MF包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)和兒茶酚胺結(jié)合(catecholamine binding)等。KEGG通路富集分析同樣以FDR<0.05為篩選條件，獲得105條具有顯著富集的通路，排名較前的通路主要為脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)和化學(xué)致癌作用-受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor)等，見圖6。

3 討論

《傷科補(bǔ)要》記載：“夫跌打損傷，墜墮磕之證，專從血論?；蛴叙鲅７e，或為亡血過多，然后施治……先逐其瘀，而后和營止痛，自無不效?！贝送狻秲?nèi)經(jīng)》云∶“形傷則痛，氣傷則腫。”又曰∶“先腫而后痛者，形傷氣也；先痛而后腫者，氣傷形也。凡打撲閃錯……致氣血凝結(jié)者，宜活血順氣之法。”因此跌打損傷的治法以活血止痛行氣為主，并要進(jìn)行及時治療。本研究通過對1 027首方劑的藥物組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)活血類藥物當(dāng)歸、乳香、沒藥、白芷、川芎、甘草、赤芍、大黃、紅花和血竭等使用頻次較高；而李彥民等[2]對《跌打大全》中的81首治療跌打損傷的方劑進(jìn)行分析，排序在前10位的藥物分別是沒藥、乳香、生地、甘草、當(dāng)歸、赤芍、紅花、防風(fēng)、三七、木香；《鄒伯奇家傳手抄本》中94首治療跌打損傷方劑中使用頻率較高的有當(dāng)歸、乳香、沒藥、紅花、地黃、桃仁、大黃、血竭、三七和赤芍等[6]；2015版《中國藥典》用于跌打損傷的29首方劑中主要使用的藥物有乳香、沒藥、冰片、當(dāng)歸、紅花、大黃、土鱉蟲、血竭、三七和白芷等[4]。綜上分析，小樣本的方劑研究與本研究結(jié)果類似，治療跌打損傷的藥物以活血止痛為主，主要有沒藥、乳香、當(dāng)歸、紅花、血竭、赤芍、大黃和三七等，這與中醫(yī)古籍記載的理論相符合。

圖5 內(nèi)服方劑核心藥組的GO富集分析

圖6 KEGG通路分析氣泡圖

通過對跌打損傷方劑中藥物歸經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)主要入肝、脾和心經(jīng)，而2015版《中國藥典》關(guān)于跌打損傷的方劑同樣表明此結(jié)論[4]?！秱蒲a(bǔ)要》載：“跌打損傷之證，惡血留內(nèi)，則不分何經(jīng)，皆以肝為主?！备尾匮?，心行之，人動則血運(yùn)于諸經(jīng)、人靜則血?dú)w于肝臟，五臟六腑之血全賴脾氣統(tǒng)攝，這三個臟腑與血液的化生、運(yùn)行具有較大的關(guān)系；此外治療跌打損傷的藥物多性辛、溫，味苦、辛能散能行，能夠發(fā)散、行血行氣，具有活血化瘀的功效，使血液流暢。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥性組合-中藥作用靶標(biāo)-生物網(wǎng)絡(luò)模塊-功效”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)辛溫藥物與化瘀散結(jié)的功效相關(guān)，而苦味與炎癥相關(guān)，體現(xiàn)了苦可宣泄瘀散的功效，其藥物主要通過調(diào)節(jié)不同靶點(diǎn)參與血小板脫粒、血液凝固、血小板活化等過程，從而發(fā)揮活血化瘀的功效[7-8]。

通過關(guān)聯(lián)分析可以找出治療跌打損傷的常用藥對，無論內(nèi)服還是外用，乳香-沒藥的支持度和置信度均較高，在《跌打大全》中同樣如此[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，乳香、沒藥具有抗炎[9]、鎮(zhèn)痛[10]等作用，此外乳香、沒藥的揮發(fā)油可能增加皮膚血流量促進(jìn)川芎等藥物的滲透[11]，說明乳香、沒藥作為外用藥時具有重要的作用，并且蔡煜林等通過對文獻(xiàn)報道中的140個治療扭傷外用膏劑處方進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其核心藥物為乳香、沒藥、大黃[12]，因此乳香-沒藥是治療跌打損傷不可或缺的一組藥對。此外，其他關(guān)聯(lián)度較高的藥對基本與當(dāng)歸有關(guān)，這與其他小樣本數(shù)據(jù)研究結(jié)果基本一致[2，4，6]，如當(dāng)歸-川芎、當(dāng)歸-赤芍、當(dāng)歸-生地等。軟組織損傷的主要病機(jī)是氣血瘀滯不通，而當(dāng)歸能行血中之氣，使血各歸其經(jīng)，藥理研究表明其具有改善外周循環(huán)、減少血管阻力、減少血栓、增加血紅蛋白等作用[13]。當(dāng)歸∶川芎的比例為4∶1～2∶1時，其養(yǎng)血補(bǔ)血效果隨著劑量的增加而增加[14]，該藥對還具有抗血栓、降低全血黏度、提升血紅細(xì)胞數(shù)等作用[15]。在外用方劑中，川烏-草烏、荊芥-防風(fēng)藥對的使用頻次也較高，雖然川烏-草烏兩者均具有較大毒性，但在外用時，其安全性得到一定的保證，并且其改善血液循環(huán)、抗炎止痛的效果也較為顯著[16-17]，配伍荊芥-防風(fēng)能夠逐風(fēng)邪、散寒濕。

關(guān)于治療軟組織損傷的作用機(jī)制研究目前大多數(shù)集中在TLR2/NF-κB信號通路中，與腫瘤壞死因子TNF、白細(xì)胞介素IL和前列腺素PGE等有關(guān)[18-19]。王偉軍等[20]和楊威等[21]分別開展的桃紅四物湯和701跌打鎮(zhèn)痛膏治療軟組織損傷的研究也對此進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)其主要通過降低CASP3、NFKB1和PTGS2的蛋白表達(dá)發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，從而收到治療效果。上述研究結(jié)果與本研究核心藥組預(yù)測的靶點(diǎn)和KEGG富集的通路基本一致，少數(shù)差異可能是由于藥物組成不同導(dǎo)致的，或者存在新的治療軟組織損傷的作用靶點(diǎn)和通路，有待進(jìn)一步實驗驗證。

本研究運(yùn)用古今醫(yī)案云平臺，對《方劑大辭典》中1 027首治療跌打損傷的方劑進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)內(nèi)服方劑核心藥組和外用方劑核心藥組，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析闡明內(nèi)服方劑的核心藥組潛在的作用機(jī)制——以多種有效成分通過PTGS2、NCOA2、PGR等靶點(diǎn)作用于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、IL-17、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等多條通路，從而發(fā)揮治療作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步實驗驗證。本研究可為治療軟組織損傷機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)，為臨床治療跌打損傷提供參考。