同屬不同種桑葉總黃酮的含量測定及分析

黃曉彤，史 銳，劉苗苗，叢龍嬌，劉斯文，王琪瑤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000)

桑葉是?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉子，我國約有11種桑葉，分布于全國大部分地區(qū)，以長江流域尤其江浙一帶為多[1]。桑葉具有降血脂[2]、抗氧化[3]、降血糖[4-5]、抗炎[6]等功效，在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域的開發(fā)價值及利用價值較高[7]，近年來被廣泛用于生產(chǎn)代用茶[8]、焙烤制品[9]等產(chǎn)品中。桑葉中活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)極其豐富，例如萜類化合物[10]、黃酮[11]、多酚[12]等。黃酮類成分是桑葉藥材發(fā)揮藥效作用的最主要成分，現(xiàn)行《中國藥典》將蘆丁這一黃酮苷類成分作為桑葉藥材含量測定的指標(biāo)性成分。桑葉在實際應(yīng)用中存在品種混淆的問題，導(dǎo)致入藥品種不明確。通過查閱古代本草發(fā)現(xiàn)，古人對不同品種桑葉進(jìn)行過研究且得出“雞桑最堪入藥”的結(jié)論，但目前中國藥典中僅收錄一種桑葉，且未明確品種，所以對桑屬不同種桑葉進(jìn)行含量測定相關(guān)研究對桑葉資源的開發(fā)利用具有十分重要的意義。因此，本研究對同屬不同種桑葉中總黃酮含量進(jìn)行測定，并采用SPSS 26.0軟件對其進(jìn)行主成分分析，為桑葉藥材質(zhì)量的評價提供實驗依據(jù)，對后續(xù)優(yōu)化桑葉提取工藝具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藥材：桑葉分別采集于江蘇鎮(zhèn)江、新疆和田以及在中檢所購買的桑葉對照藥材，以上樣品由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國教授鑒定為?？粕偕涞娜~子，樣品序號、來源、采集時間等，詳見表1。

試劑：無水乙醇(沈陽市新化試劑廠)；HPD100大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；蒸餾水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)；氫氧化鈉(天津大茂試劑廠)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(成都格利普生物科技有限公司，批號：T27F10Z81699)；硝酸鋁(天津大茂試劑廠)；亞硝酸鈉(天津大茂試劑廠)。

表1 桑葉的樣品來源

1.2 儀器與設(shè)備

UV5100紫外可見-分光光度計(安徽皖儀科技股份有限公司)；FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器設(shè)備有限公司)；中藥篩子(紹興市上虞英華貿(mào)易有限公司)；KQ5200DB型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 桑葉總黃酮含量測定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取5.18 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，放置于25 mL容量瓶，用70%的乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，即得到0.207 2 mg/mL質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備 取桑葉粉末2 g，精密稱定，加30 mL石油醚(60～90 ℃)，加熱回流30 min，棄去石油醚液，藥渣揮干，向體系中加入30 mL乙醇，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加熱水10 mL，置60 ℃水浴上攪拌使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇使其充分溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液6份，每份分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，精密稱取后放置于25 mL容量瓶，向體系中加入1.0 mL 5%的NaNO2，充分混勻后放置6 min左右；精密量取1.0 mL的10%Al(NO3)3加入體系中，充分搖勻后靜置6 min；向體系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇溶液適量，定容至刻度線，搖勻靜置15 min。得到濃度為1.66 μg/mL、3.32 μg/mL、4.97 μg/mL、6.64 μg/mL、8.30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以70%的乙醇溶液作為空白對照溶液，測定其在510 nm處的吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為X軸，Y軸為吸光度(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性回歸方程。

2.2 桑葉樣品總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取桑葉13份，每份1.00 g，分別制備13份供試品溶液，向體系中加入1.0 mL5%的NaNO2，充分混勻，靜置6 min左右；加入1.0 mL的10%Al(NO3)3，充分搖勻，放置6 min；向體系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇，并定容到刻度線，搖勻后放置15 min。同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，進(jìn)行基準(zhǔn)校正后，用紫外可見分光光度計測定510 nm處的吸光度值。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，于510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，平行測定6次，計算RSD值。

2.3.2 穩(wěn)定性考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，依次在 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h 時，于510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，計算RSD值。

2.3.3 重復(fù)性考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，6份，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時以70% 的乙醇作為空白對照，于510 nm波長處分別測定6份樣品的吸光度值A(chǔ)，計算RSD值。

2.3.4 加樣回收率考察 量取已知含量的藥材粉末(樣品3，魯桑)1.0 g，精密稱定，按照 0.8∶1，1∶1，1∶1.5 比例加入蘆丁對照品，各平行測定3份，一共9份樣品，按“2.2”項下方法分別制備9份供試品溶液，同時以70% 的乙醇作為空白對照，于510 nm波長處分別測定6份樣品的吸光度值A(chǔ)，計算RSD值。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為X軸，吸光度(A)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.076 1x+0.070 4(R2=0.999 3)。由結(jié)果可知其在1.66 μg/mL～8.30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 精密度考察 精密度考察結(jié)果見表2，6次吸光度的RSD值為1.19%，表明儀器精密度良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 精密度測定結(jié)果

3.2.2 穩(wěn)定性考察 穩(wěn)定性考察結(jié)果見表3，0～24 h內(nèi)測定的吸光度的RSD值為 1.12%，說明桑葉藥材總黃酮提取物在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3.2.3 重復(fù)性考察 重復(fù)性考察見表4，6個樣品吸光度的RSD值為1.41%，說明該方法重復(fù)性較好。

表3 穩(wěn)定性測定結(jié)果

表4 重復(fù)性測定結(jié)果

3.2.4 加樣回收率考察 加樣回收率考察結(jié)果見表5，按比例依次得到加樣回收率平均值為99.08%、99.28%、99.94%，RSD值分別為 0.43%、1.06%、0.30%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.3 不同桑種桑葉中總黃酮含量測定結(jié)果

精密稱取13份桑葉粉末，每份1.00 g，制備供試品溶液，采用“2.1”項下方法測定不同種樣品總黃酮含量，不同種間總黃酮含量存在差異性，結(jié)果見圖2。

圖2 同屬不同種桑葉總黃酮含量比較

表5 加樣回收率考察結(jié)果

含量測定結(jié)果顯示，華桑中總黃酮含量最高為23.18 mg/g，其次是雞桑21.45 mg/g、山桑19.05 mg/g、蒙桑20.35 mg/g等。

3.4 桑屬不同桑種桑葉的綜合質(zhì)量研究

本實驗以測量的總黃酮含量為原始數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 26.0軟件對其進(jìn)行主成分分析，計算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率(表6)，以特征值(VIP)>0.5 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前兩個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為 84.776%(>80%)，同時碎石圖(圖3)也清晰呈現(xiàn)出各主成分所代表信息的走勢情況，說明前2個主成分反映了桑葉藥材中84.776%的信息量。

總黃酮成分得分系數(shù)矩陣顯示，成分1為0.243、成分2為0.920。為了綜合評價以黃酮為變量的桑葉藥材整體質(zhì)量，根據(jù)成分得分矩陣對各主成分的載荷值進(jìn)行計算，并根據(jù)其綜合得分的高低對不同種桑葉的質(zhì)量進(jìn)行排序，結(jié)果見表7，雞桑綜合排名第一。

表6 主成分信息和方差貢獻(xiàn)率

圖3 碎石圖

表7 綜合得分排名

4 討論

桑葉主要以輔助降壓及輔助降血脂為主要作用，桑葉黃酮可促進(jìn)膽固醇含量的增加，從而改善高脂血癥大鼠模型SOD的活性，抑制丙二醛MDA的生成[13]。近年來相關(guān)研究得出，黃酮和多糖所具有的抗氧化、清除自由基作用，可修復(fù)或保持胰島素β細(xì)胞的生理功能，促進(jìn)膜島素分泌，降低血糖。Hunyadi A等[14]發(fā)現(xiàn)異槲皮苷、蘆丁和綠原酸能有效降低2型糖尿病大鼠模型血糖。因此，黃酮中主要藥效成分含量的多少對臨床應(yīng)用具有一定的影響，故選取總黃酮為指標(biāo)成分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，本研究對同屬不同種桑葉進(jìn)行了總黃酮含量的測定，為鑒別不同種桑葉提供方法學(xué)基礎(chǔ)，為確保臨床精準(zhǔn)用藥提供實驗依據(jù)。

本實驗選擇總黃酮的測量結(jié)果為原始數(shù)據(jù)對其進(jìn)行分析，提取出的主成分方差貢獻(xiàn)率為84.776%(>80%)，是造成種間差異的主要成分。因此根據(jù)得分系數(shù)對每個樣品的總得分進(jìn)行計算，對不同種桑葉進(jìn)行綜合排名。實驗結(jié)果顯示，雞桑綜合排名第一，與本草考證中“雞桑，最堪入用”的理論相互驗證。在此基礎(chǔ)上，有待進(jìn)行藥理學(xué)研究對此理論進(jìn)一步佐證。