甜茶飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張?bào)爿?，卿麗婷，吳家超，蔣 林，2，林青華，2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200)

甜茶為薔薇科植物甜葉懸鉤子RubussuavissimusS.Lee的干燥葉，可清熱、潤(rùn)肺、祛痰、止咳[1-2]，是廣西特有的集藥、茶、糖于一體的藥食同源類植物，開發(fā)前景廣闊[3]?！疤鸩琛钡耐愇锲贩N眾多，其中廣西將可代茶飲的甜味植物均稱為“甜茶”，上海、浙江、江蘇、湖北、江西將虎耳草科植物傘形繡球、傘花繡球、臘蓮繡球和菊科植物甜葉菊的干燥葉也稱為“甜茶”[4]，本研究所指甜茶均為薔薇科植物甜葉懸鉤子的干燥葉。甜茶藥材在廣西[1-2]、貴州[5]的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有所收載，相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究雖有文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，但飲片才是供臨床調(diào)劑及中成藥生產(chǎn)的配方原料[8]，而甜茶飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)卻未在《中國藥典》及各省(區(qū))、市炮制規(guī)范中收載，也未見甜茶飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)報(bào)道。甜茶飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的缺失不利于其質(zhì)量控制和產(chǎn)品開發(fā)，故亟需建立甜茶飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保障臨床應(yīng)用及中成藥生產(chǎn)等方面的質(zhì)量要求。故本研究參照2020年版《中國藥典》(四部)附錄的相關(guān)內(nèi)容，對(duì)甜茶飲片進(jìn)行定性鑒定和定量研究，以期為建立甜茶飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考及依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

甜茶藥材來源(經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室朱意麟老師鑒定為薔薇科植物甜葉懸鉤子RubussuavissimusS.Lee的干燥葉)見表1；甜茶苷對(duì)照品(純度>98.0%，批號(hào)：MUST-19070201，中國科學(xué)院成都生物研究所)。

表1 10批甜茶藥材編號(hào)與來源

1.2 儀器與試劑

Agilent-1260高效液相色譜儀(Agilent公司)，Ultimate?XB-C18色譜柱(月旭科技)；色譜級(jí)乙腈(Thermo Fisher Scientific)，Direct-Q5UV型超純水儀一體機(jī)(廣西南寧博美生物科技有限公司)；DMB-1223型生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，硅膠G板(青島海洋化工有限公司)，甲醇、甲苯、甲酸、乙酸乙酯、水合氯醛、丙三醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

不同產(chǎn)地的10批甜茶藥材常水軟化、切絲、干燥；參照《中國藥典》“藥材和飲片檢定方法”對(duì)甜茶飲片進(jìn)行描述。甜茶飲片的性狀特征呈絲片狀。上表面呈深棕色或黃綠色，較光滑，下表面呈灰棕或淺綠色；上表面主脈明顯，下表面主脈和側(cè)脈凸出，網(wǎng)脈明顯，邊緣平滑或具小鋸齒。近革質(zhì)，質(zhì)脆，氣微，味甜。

2.2 顯微鑒別

參照《中國藥典》“顯微鑒別法”進(jìn)行甜茶飲片粉末的顯微鑒別。甜茶飲片的顯微鑒別特征為：甜茶粉末呈黃綠色或棕褐色。表皮細(xì)胞類圓形或類方形，可見不定式氣孔。非腺毛較多，單細(xì)胞，散在，多碎斷，完整者基部細(xì)胞粗短膨大，壁較厚，有疣狀突起，長(zhǎng)85～175 μm。薄壁細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣簇晶，常排列成行，也有的單個(gè)散在，直徑8～18 μm。可見螺紋或環(huán)紋導(dǎo)管，以螺紋導(dǎo)管為主，常見于葉肉細(xì)胞中。偶見棕色塊，類圓形，顏色深淺不一。見圖1。

注：1.表皮細(xì)胞；2.非腺毛；3.柵欄組織；4.草酸鈣蔟晶；5.導(dǎo)管；6.棕色塊。

2.3 薄層色譜鑒別

取甜茶飲片粗粉1 g，加10 mL甲醇，超聲處理0.5 h后濾取濾液，蒸干，加2 mL甲醇復(fù)溶，即得供試品溶液；稱取甜茶苷對(duì)照品適量加甲醇溶解(0.1 mg/mL)，即得對(duì)照品溶液。參照《中國藥典》“薄層色譜法”，分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板(預(yù)先于105 ℃活化30 min)上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶4∶0.9)為展開劑進(jìn)行展開，取出，晾干后噴10% 硫酸乙醇溶液顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品與對(duì)照品在硅膠G板的相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

2.4 水分、灰分和浸出物測(cè)定

分別參照《中國藥典》“水分測(cè)定法(烘干法)”“灰分測(cè)定法”和“浸出物測(cè)定法(水溶性浸出物，熱浸法)”進(jìn)行甜茶飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物測(cè)定。結(jié)果表明，10批甜茶飲片的水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的含量分別為9.52%～11.72%、4.63%～5.61%、0.07%～0.19%和36.27%～39.02%，見表2。根據(jù)上限值上浮20%、下限值下浮20%的原則[9-10]，擬定甜茶飲片的水分、總灰分和酸不溶性灰分的含量分別不得高于14.0%、7.0%和0.23%，水溶性浸出物的含量不得低于29.0%。

圖2 甜茶飲片供試品(1～10)與甜茶苷對(duì)照品(T)在日光下的薄層色譜

表2 甜茶飲片中水分、總灰分、酸不溶性灰分與水溶性浸出物含量 (%)

2.5 甜茶苷含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 取甜茶苷適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1 mL含甜茶苷1 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 取甜茶飲片粉末(過五號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置離心管中，精密加50%乙醇25 mL，蓋緊并用封口膜封嚴(yán)，超聲處理1 h，放冷，離心(3 500 r/min，10 min)，小心傾取上清液，殘?jiān)侔瓷鲜龇椒ㄌ崛?次，合并兩次提取液，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5.3 色譜條件 色譜柱：Ultimate?XB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液(35∶65)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；波長(zhǎng)：205 nm。對(duì)照品與供試品的HPLC圖，見圖3。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL，置于不同的10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，制成系列濃度的對(duì)照品溶液，搖勻，取續(xù)濾液進(jìn)樣并記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，得回歸方程Y=8 211.100 93X+25.068 36，r=0.999 9，說明甜茶苷對(duì)照品在1 011.0～101.1 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5.5 方法學(xué)考察 精密吸取“2.5.4”項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算甜茶苷對(duì)照品的RSD為0.06%，說明儀器精密度良好；取同一份甜茶飲片樣品，按“2.5.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按峰面積計(jì)算甜茶苷的RSD為1.93%，說明供試品制備方法重現(xiàn)性良好；取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h依次進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算甜茶苷對(duì)照品的RSD為0.27%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取已知含量的甜茶飲片樣品6份，分別加入相同量的甜茶苷對(duì)照品，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣，計(jì)算甜茶飲片中甜茶苷的平均回收率及RSD分別為101.57%和0.66%，說明“2.5.2”項(xiàng)下供試品的制備方法能將甜茶飲片中甜茶苷提取完全，滿足含量測(cè)定的要求。

2.5.6 樣品含量測(cè)定 10批甜茶飲片進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，其甜茶苷含量為3.06%～5.13%。根據(jù)甜茶苷含量下限值的80%制訂限量標(biāo)準(zhǔn)，擬定甜茶飲片中甜茶苷的含量不得低于2.5%。

3 討論

甜茶苷，又名甜茶素、甜葉懸鉤子苷，是甜茶的主要甜味成分，其甜度高、熱量低，具有降血壓、降血糖等多種作用，在食品、醫(yī)藥行業(yè)極具開發(fā)價(jià)值[11]。因此，本研究選用甜茶苷作為對(duì)照品，對(duì)甜茶飲片進(jìn)行薄層定性鑒定和HPLC含量檢測(cè)。

3.1 薄層鑒別

本實(shí)驗(yàn)在參考甜茶藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5]及其研究報(bào)道[7]的基礎(chǔ)上，考察了多種展開系統(tǒng)(氯仿-甲醇-水、正丁醇-乙酸-水、環(huán)己烷-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)對(duì)供試品和對(duì)照品的展開效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶4∶0.9)為展開劑時(shí)，供試品、對(duì)照品在硅膠G薄層板上的分離效果好,斑點(diǎn)清晰不拖尾,且Rf值適中。此外，有學(xué)者在甜茶藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過程中將金絲桃苷、蘆丁作為對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別[6]，但兩者在中藥飲片中廣泛存在，專屬性差，故本實(shí)驗(yàn)在甜茶飲片薄層鑒別中對(duì)金絲桃苷、蘆丁未予考慮。

圖3 50%乙醇(A)、甜茶苷對(duì)照品(B)與甜茶飲片供試品(C)在205 nm處的HPLC

3.2 含量測(cè)定

甜茶苷的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較多[7，12-17]，為優(yōu)選甜茶飲片中甜茶苷的含量測(cè)定方法提供了參考。但也存在方法陳舊[15]、甜茶苷出峰時(shí)間過早(tR<5 min)[12，14]或過晚(tR≈20 min)[17]等不足之處。目前，HPLC仍是藥物含量測(cè)定的主流方法，故本研究在借鑒文獻(xiàn)報(bào)道[7，13]的基礎(chǔ)上，綜合考慮甜茶苷的分離度與出峰時(shí)間，最終優(yōu)選出以乙腈- 0.1%磷酸水溶液(35∶65)為流動(dòng)相的HPLC條件，在該條件下甜茶苷分離度良好、出峰時(shí)間適中(見圖3)，經(jīng)方法學(xué)考察其能夠滿足甜茶飲片中甜茶苷含量測(cè)定的需求。此外，本實(shí)驗(yàn)亦對(duì)制備供試品的提取溶劑(甲醇、乙醇及其濃度)、料液比(50倍、100倍)、提取方法(超聲法、回流法)、提取時(shí)間(0.5 h、1 h)、提取次數(shù)(1次、2次、3次)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，甜茶飲片供試品的最佳制備方法為50倍量的50%乙醇超聲法提取2次，每次1 h。由于提取液黏度大，在濾取藥渣進(jìn)行再次提取的過程中濾過困難，極易產(chǎn)生誤差，故將樣品置于離心管(50 mL為佳)中超聲處理，以便后續(xù)離心，再次提取，但需考察50%乙醇對(duì)離心管的影響。

本研究建立的甜茶飲片定性、定量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定、可靠，可用于甜茶飲片的質(zhì)量控制。