基于NIRS及HPLC的經(jīng)典名方中苦杏仁炮制工藝研究

毛九州，李 帥，朱紅梅，張愛(ài)軍

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041)

苦杏仁為薔薇科植物山杏(PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.)、西伯利亞杏 (PrunusSibiricaL.)、東北杏(PrunusmandshuricaKoehne)、杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟種子[1]，有小毒。國(guó)家中醫(yī)藥管理局會(huì)同相關(guān)部門(mén)于2018年4月13日發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[2]中第32首為小續(xù)命湯，目錄中給出了其原方描述、出處、組成、用法制法及劑型。早在1 400余年前，小續(xù)命湯首載于孫思邈的《備急千金要方》。在漫長(zhǎng)的臨床實(shí)踐中，方劑中所述的藥材從基原、產(chǎn)地、藥用部位、加工還是炮制均出現(xiàn)了變化，因此筆者認(rèn)為應(yīng)盡可能地選擇與古方或者長(zhǎng)期應(yīng)用最為接近的藥物，過(guò)渡至現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)或選擇與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定最為接近的藥物[3-4]。經(jīng)文獻(xiàn)考證以及2020年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定，建議本研究中苦杏仁按2020年版《中國(guó)藥典》的燀苦杏仁照燀法(通則 0213)去皮，用時(shí)搗碎[5]。

苦杏仁在中藥方劑中廣泛使用，主要用于治療咳嗽氣喘、胸滿痰多、腸燥便秘等，具有降氣止咳、平喘、潤(rùn)腸通便的作用[6]。然而，苦杏仁有些許毒性，由于苦杏仁酶可以使苦杏仁苷轉(zhuǎn)變?yōu)橐皺衍?，野櫻酶可繼續(xù)水解野櫻苷產(chǎn)生杏仁腈，最后，杏仁腈在酶的作用下可以產(chǎn)生苯甲醛和氫氰酸，從而導(dǎo)致中毒，甚至呼吸麻痹。經(jīng)加熱炮制后的苦杏仁，苦杏仁酶被殺死進(jìn)而降低苦杏仁的毒性，殺酶保苷的作用顯現(xiàn)出來(lái)[7]。并且，炮制苦杏仁可以在保留有效成分的前提下，除去非藥用部分。因此《中國(guó)藥典》2020 年版四部(通則 0213)炮制通則中規(guī)定燀法：取待炮制品投入沸水中，翻動(dòng)片刻，撈出，放入冷水中，除去種皮，曬干[6]。但該法未明確寫(xiě)明燀制加水量、燀制時(shí)間、干燥溫度和干燥時(shí)間等條件，本研究考察苦杏仁的炮制工藝參數(shù)，以期為燀苦杏仁的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

近紅外光譜技術(shù)(NIRS)因具有實(shí)時(shí)快速、無(wú)損、成本較低、環(huán)境污染較小等特點(diǎn)，已在炮制過(guò)程中得到了廣泛應(yīng)用。本研究將其應(yīng)用NIRS技術(shù)快速對(duì)苦杏仁進(jìn)行定性及定量測(cè)定，以期有利于苦杏仁炮制品的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

液相色譜儀(安捷倫公司，美國(guó)，型號(hào)：1260型)；電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：XS205)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器，型號(hào)：KQ-300B)；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(成都電烘箱廠，型號(hào)：DB-207)；藥典篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司，型號(hào)：2號(hào)篩)；近紅外光譜儀(步琦公司，瑞士，型號(hào)：NIR Flex N-500)，石英玻璃樣品池、樣品旋轉(zhuǎn)器漫反射積分球、數(shù)據(jù)處理軟件(步琦公司，瑞士，型號(hào)：NIRcal 5.4)。

1.2 試藥

苦杏仁苷(110820-201808，HPLC 88.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。各批藥材均于當(dāng)年3月份采摘，裝在塑封袋中，貯存于干燥密閉條件下，具體藥材信息見(jiàn)表1。炮制研究所用苦杏仁為(山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim 購(gòu)于山西省長(zhǎng)治市平順縣)產(chǎn)地篩選KXR01，02，03，04，05，06共6批樣品均勻取樣，各取300 g，混合而成1 800 g。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水用怡寶純凈水。近紅外掃描樣品為苦杏仁優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地原藥材粉末01～15批(過(guò)2號(hào)篩)，優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地?zé)砜嘈尤史勰?1～15批，產(chǎn)地篩選原藥材粉末01～18批，產(chǎn)地篩選不同炮制方法燀苦杏仁飲片粉末01～12批，具體信息如表1。

表1 藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 干燥條件的選擇

2.1.1 不同干燥品的制備 根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》四部(通則 0213)炮制通則明確規(guī)定：燀法，水溫為沸水[5]。本次燀制工藝的考察以苦杏仁苷含量為指標(biāo)，先進(jìn)行適宜干燥條件的考察，包括干燥溫度和干燥時(shí)間兩個(gè)因素。確定干燥條件后，再進(jìn)行加水量、燀制時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)炮制品質(zhì)量影響的考察。預(yù)試實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了5倍、7倍、10倍水量的試驗(yàn)，由于采用5倍水量燀制易煮干，未能達(dá)到合理的燀制時(shí)間，所以排除5倍水量，優(yōu)選7倍、10倍水量因素。

本次試驗(yàn)擬將苦杏仁600 g采用7倍水量燀制10 min，先均分后考察不同的干燥方法[8]。結(jié)合文獻(xiàn)[9]可知，選擇40 ℃用于干燥，消耗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，100 ℃干燥溫度易使樣品表面出現(xiàn)焦斑，性狀不符合《中國(guó)藥典》要求，故考察的干燥條件由表2所示。

每份樣品至少50 g。由于苦杏仁含有杏仁油，每份樣品應(yīng)整粒放入烘箱，不可敲碎或粉碎后進(jìn)入烘箱，避免杏仁油揮發(fā)導(dǎo)致誤差。為使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，將所有干燥樣品分別用打粉機(jī)粉碎后再進(jìn)行含量測(cè)定。

表2 考察干燥條件 (n=2)

2.1.2 炮制品的制備 生苦杏仁：取原藥材，除去雜質(zhì)、殘留的核殼及褐色油粒；燀苦杏仁：取凈苦杏仁50 g，置下表所示水量的沸水中，加熱煮時(shí)間如表3所示，至苦杏仁膨脹，種皮易脫落時(shí)，撈出，置冷水稍浸，立即取出，搓去種皮，篩去種皮[10]。干燥方法采用“2.1.1”項(xiàng)下選出的方法。

表3 考察燀制條件 (n=3)

每份樣品至少50 g。采用“2.1.1”選出的干燥條件進(jìn)行烘干，樣品粉碎稱量進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2 苦杏仁各干燥品、炮制品的苦杏仁苷含量比較

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(8∶92)為流動(dòng)相等度洗脫。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品，用甲醇溶解為44.17 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各干燥條件的樣品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱重，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，冷卻后補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 mL于50 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm濾膜。

2.2.4 含量測(cè)定結(jié)果 供試品溶液10 μL注入HPLC，色譜如圖1所示，根據(jù)峰面積計(jì)算苦杏仁苷含量，含量以3次測(cè)得的平均值計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。根據(jù)結(jié)果確定燀制工藝后，將優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地藥材統(tǒng)一按燀制工藝進(jìn)行炮制后，測(cè)定其苦杏仁苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 干燥品含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

表5 炮制品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

表6 原藥材及炮制品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

2.3 苦杏仁炮制品的過(guò)氧化值比較

2.3.1 試驗(yàn)條件 苦杏仁各炮制品的過(guò)氧化值根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》四部(通則2303)酸敗度測(cè)定法進(jìn)行試驗(yàn)。正己烷、三氯甲烷、冰醋酸等試劑均為分析純、新制碘化鉀飽和溶液、硫代硫酸鈉滴定液等按要求配制。

2.3.2 油脂提取 取樣品30 g(初粉)，置索氏提取器中，加正己烷120 mL后水浴加熱回流2 h，放冷，用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，濾液減壓回收溶劑至盡，殘留物為油脂。

2.3.3 過(guò)氧化值測(cè)定 取油脂2 g，精密稱定，置250 mL的干燥碘瓶中，加三氯甲烷-冰醋酸(1∶1)混合溶液30 mL溶解。精密加入新制碘化鉀飽和溶液1 mL密塞，輕輕振搖半分鐘，在暗處放置3 min，加水100 mL，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01 mol/L)滴定至其呈淺黃色時(shí)，加淀粉指示液1 mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失；同時(shí)做空白試驗(yàn)，照公式計(jì)算。

2.3.4 過(guò)氧化值結(jié)果 苦杏仁各炮制品的過(guò)氧化值結(jié)果如表7。

表7 炮制品過(guò)氧化值結(jié)果 (n=2)

2.4 燀制工藝小結(jié)

由表4結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)80 ℃、2 h干燥的樣品，其苦杏仁苷平均含量在樣品中最高，結(jié)合所需干燥時(shí)間和節(jié)約熱能的考慮，確定燀苦杏仁樣品的干燥條件為80 ℃下放置2 h。

預(yù)試驗(yàn)曾通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)燀制水量進(jìn)行初步篩選，5倍量水量較少，即使加熱時(shí)間為最短的5 min，仍有燒干的風(fēng)險(xiǎn)，后續(xù)試驗(yàn)的水平為7倍水量及10倍水量。由表5結(jié)果可知，在同樣水量燀制的條件下，燀制10 min含量最高。所以燀制時(shí)間選用10 min，用水量需結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)以及節(jié)約水資源的考慮，7倍量水已足夠用于苦杏仁的燀制，7倍量水燀制10 min與10倍量水燀制10 min的含量相差0.11%，結(jié)合過(guò)氧化值的數(shù)據(jù)(表7)分析，7倍量水燀制10 min樣品的過(guò)氧化值最小，所以燀制方法選擇7倍量水燀制10 min。優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地藥材同樣進(jìn)行炮制，含量測(cè)定結(jié)果如表6。

臧彬如等[8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選燀苦杏仁的工藝是加水量10倍，煮沸10 min，搓去皮，在電熱鼓風(fēng)干燥箱60 ℃條件下，干燥6 h。種振等取凈苦杏仁，加入12倍的沸水中，燀制5 min，取出，置于冷水中浸制3 min，搓去種皮，置于70 ℃烘箱中，干燥，即可[11]。上述文獻(xiàn)研究所得工藝各不相同，本研究以燀苦杏仁的指標(biāo)性成分苦杏仁苷含量、過(guò)氧化值等多指標(biāo)代替單一指標(biāo)來(lái)優(yōu)選燀苦杏仁炮制工藝，所用水量較少，更適合工廠規(guī)?；a(chǎn)。結(jié)合近紅外光譜技術(shù)，可在炮制過(guò)程中進(jìn)行質(zhì)量控制，一定程度上為燀苦杏仁的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

2.5 近紅外研究

2.5.1 近紅外光譜的采集 取適量樣品粉末，置于平坦干凈的培養(yǎng)皿中，并使之均勻分布于皿底部。以儀器內(nèi)置背景為參比，用NIR FLEX N-500型近紅外光譜儀進(jìn)行掃描，采用積分球附件測(cè)量，分辨率8 cm-1；掃描范圍：4 000～10 000 cm-1，掃描次數(shù)8次，每個(gè)樣品重復(fù)裝樣掃描3次。光譜數(shù)據(jù)取 3 次采樣的平均值。

2.5.2 光譜直觀比較 優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地苦杏仁原藥材粉末、產(chǎn)地篩選苦杏仁原藥材粉末、優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地?zé)砜嘈尤曙嬈勰?、產(chǎn)地篩選不同炮制方法燀苦杏仁飲片粉末共68批次的近紅外原始光譜見(jiàn)圖2，相同種類(lèi)不同來(lái)源或批次的樣品，原始光譜基本一致。

2.5.3 光譜預(yù)處理及結(jié)果 為避免樣品中含有的無(wú)關(guān)因素干擾近紅外光譜，需對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。NIRS法建模時(shí)常用的預(yù)處理方法有標(biāo)準(zhǔn)正則變換(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(db1)、標(biāo)準(zhǔn)化(ncl)、多元散射校正(mf)等[12]。

本實(shí)驗(yàn)在NIRcal 5.4數(shù)據(jù)處理軟件中導(dǎo)入68批已采集好的198條光譜，按照6∶3的比例對(duì)樣品分為定標(biāo)集(C-set)和驗(yàn)證集(V-set)。采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀所帶的 NIRcal 5.4 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行自動(dòng)建模，系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)選中光譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和微分計(jì)算，選取不同波段比例、不同波段范圍、不同前處理方法對(duì)原始的NIRS圖進(jìn)行處理，旨在有效消除基線飄移，更全面地反映不同樣品之間的信息差異，根據(jù)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)(Q值)選出最優(yōu)模型，預(yù)處理結(jié)果見(jiàn)表8。

選用采用Clustar 方法進(jìn)行建模，選擇將數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱的轉(zhuǎn)化到0-1*后進(jìn)行Between 0 and 1*，1st BCAP(n01，db1)的前處理方法對(duì)光譜進(jìn)行前處理，由表8可知，最佳建模結(jié)果為選取5 000～10 000cm-1波段的圖譜，最終處理效果如圖3。

注：樣品編號(hào)1：DKXR01-15；編號(hào)2：KXR01-15；編號(hào)3：KXR01-15；編號(hào)4：DKXR01-06。

表8 預(yù)處理結(jié)果

2.5.4 定性模型的建立 按照83%的波段比例對(duì)，5 000～10 000cm-1的波段，通過(guò)NIR，采用聚類(lèi)分析方法，可將DKXR與KXR進(jìn)行區(qū)分。圖4中的橫坐標(biāo)表示主成分l(PC1)的得分值，縱坐標(biāo)表示主成分2(PC2)的得分值[12]，DKXR與KXR樣品明顯地聚類(lèi)為互相獨(dú)立的2組。由圖4、圖5可知，此模型可以較好地將DKXR與KXR樣品分開(kāi)，通過(guò)NIR可以將DKXR和KXR較好地進(jìn)行區(qū)分。

圖3 預(yù)處理光譜

圖4 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分二維得分圖

圖5 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分三維圖

2.5.5 NIRS定性模型的驗(yàn)證 對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，以屬性距離和光譜殘差來(lái)表示模型驗(yàn)證過(guò)程中光譜判別的依據(jù)[13]，DKXR所允許的最大距離為0.057 580；最大允許殘差為0.000 523；KXR所允許的最大距離為0.013 076，最大允許殘差0.000 523。在該模型中所有驗(yàn)證集和校正集光譜均被正確判斷，準(zhǔn)確率100%。

2.5.6 DKXR、KXR部分樣品建立定性模型 為苦杏仁和燀苦杏仁使用定性模型區(qū)分，將4類(lèi)樣品，分為建模組和外部驗(yàn)證組，如表9所示。原始光譜如圖6所示。

表9 分組情況

預(yù)處理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀自帶的 NIRcal 5.4數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行自動(dòng)建模，根據(jù)Q值判斷處理結(jié)果，Q值越大效果越好。

由表10可知，最佳建模結(jié)果為選取83%波段比例、5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1波段的圖譜，采用n01，db1的前處理方法對(duì)光譜進(jìn)行前處理，處理效果如圖7。

圖6 近紅外光譜疊加圖

按照79%的波段比例對(duì)5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1的波段，通過(guò)NIR，采用聚類(lèi)分析方法，可將DKXR與KXR進(jìn)行區(qū)分。由圖8可知，此模型可以較好地將DKXR與KXR樣品分開(kāi)，DKXR與KXR可以較好地分離。將54批樣品用于建模，按照6∶3的比例劃分樣品的定標(biāo)集(C-SET)和驗(yàn)證集(V-SET)，由結(jié)果可知KXR最大距離：0.000 030，最大允許殘差：0.005 049，DKXR最大距離：0.042 086，最大允許殘差：0.005 049。外部驗(yàn)證結(jié)果為6批DKXR樣品均能準(zhǔn)確驗(yàn)證，準(zhǔn)確率為100%。內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果為驗(yàn)證和校正集均被準(zhǔn)確判斷，準(zhǔn)確率為100%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明DKXR，KXR部分樣品也可建立定性模型，模型準(zhǔn)確率較高。

表10 預(yù)處理結(jié)果

2.5.7 定量模型的建立 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇是從采集光譜的68批樣品中，結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定苦杏仁藥材及炮制品的苦杏仁苷含量作為其化學(xué)真值，建立起定量分析模型。選取45個(gè)有代表性的樣品組成校正集，剩余23個(gè)樣品為驗(yàn)證集，驗(yàn)證集樣品的含量在校正集含量范圍內(nèi)，用于近紅外模型的建立。圖10為68批KXR及DKXR近紅外光譜疊加圖。

圖7 預(yù)處理光譜

圖8 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分二維得分圖

預(yù)處理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀自帶的 NIRcal 5.4 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行自動(dòng)建模，根據(jù)Q值判斷處理結(jié)果，如表11所示。

由表11可知，最佳建模結(jié)果為選取83%波段比例、5 000～10 000 cm-1波段的圖譜，采用SNV、db1的前處理方法對(duì)光譜進(jìn)行前處理，處理效果如圖11。

圖9 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分三維圖

圖10 68批KXR及DKXR近紅外光譜疊加圖

表11 預(yù)處理結(jié)果

由結(jié)果可知，校正集和驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.937 2 和0.922 2，校正集和驗(yàn)證集公式分別為f(x)=0.937 2x+0.392 9，f(x)=1.030 7x-0.999 9，表明該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，快速可靠。模型具體參數(shù)見(jiàn)圖12。

3 討論

目前關(guān)于近紅外光譜技術(shù)在苦杏仁粉末的定性鑒別和定量測(cè)定的應(yīng)用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，且僅有報(bào)道的文獻(xiàn)只研究了基于近紅外高光譜成像技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地苦杏仁和桃仁藥材的定性鑒別[14]及中藥液體制劑提取過(guò)程的近紅外定量測(cè)定苦杏仁苷[15]，采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)苦杏仁炮制品進(jìn)行測(cè)定相關(guān)方面，筆者未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。中藥材成分繁多，傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法是高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些常規(guī)分析方法耗時(shí)耗力，成本較高，屬于事后檢驗(yàn)。近紅外光譜法測(cè)定法可初步應(yīng)用于苦杏仁藥材及飲片質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)。

本研究仍存在一些不足之處，采用的樣本量不夠大，需采集更多產(chǎn)地的苦杏仁藥材及飲片光譜補(bǔ)充到定量模型中，提高定量模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

圖11 預(yù)處理光譜

圖12 苦杏仁中苦杏仁苷的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值相關(guān)性

本研究通過(guò)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)典名方中的燀苦杏仁炮制工藝及干燥條件進(jìn)行了研究，基于NIRS、HPLC優(yōu)選出了燀苦杏仁最佳炮制工藝，初步建立了對(duì)于苦杏仁炮制品的近紅外定性及定量模型，對(duì)保證燀苦杏仁飲片的質(zhì)量具有一定的意義。