十一方藥酒的體外抑菌作用研究

劉舒凌，黃 娟，唐 杰，陳宏夏，張超裕，屈澤強*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

十一方藥酒由廣西骨科名老中醫(yī)梁錫恩所提供的驗方制成，為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的傳統(tǒng)外用制劑。主要由乳香、沒藥、紅花、自然銅(煅)、續(xù)斷、龍血竭、三七等藥物組成，具有活血止痛、消腫散瘀的功效，用于治療跌打損傷、骨折筋傷和瘀血腫痛等疾患[1-2]。臨床實踐表明，十一方藥酒用于治療創(chuàng)傷性出血、創(chuàng)傷性化膿性感染及開放性骨折的傷口處理等取得了顯著效果[3]。以往的藥理研究發(fā)現(xiàn)：十一方藥酒對大鼠實驗性骨折、兔膝骨關(guān)節(jié)炎以及大鼠深Ⅱ度燙傷模型均具有治療作用[4-6]，但目前十一方藥酒抑菌作用的研究很少，是否具有抗菌作用尚不十分明確。因此，本研究選取5種受試菌對十一方藥酒的體外抑菌作用進行研究，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為十一方藥酒的進一步開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、白色念珠菌(Moniliaalbican)[CMCC(F)98001]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonellapara-typhiB)[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]以及表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)[CMCC(B)26069]均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1103581)；水解酪蛋白脲(M-H)肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1103531)。

1.3 藥物和試劑

十一方藥酒(課題組自制[2]，其濃度為含生藥量193 mg/mL的藥液，批號：20200302)；白酒(酒精度：50°，南寧軍正食品廠)；生理鹽水(回音必集團江西東亞制藥有限公司，批號：2020103113)；麥?zhǔn)媳葷峁?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：5109227)。

1.4 儀器

SW-CJ-1F型超凈臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法2.1 供試液的制備

分別取十一方藥酒和白酒，用0.22 μm針頭過濾器進行過濾除菌[7]，備用。

2.2 抑菌活性的測定

抑菌活性測定分兩步進行，第一步采用瓊脂稀釋法進行濃度初篩，觀察不同濃度十一方藥酒對5種受試菌株的體外抑菌效果，測定最低抑菌濃度(MIC)；第二步采用試管二倍稀釋法測定十一方藥酒對5種受試菌株的最低殺菌濃度(MBC)。

2.2.1 瓊脂稀釋法抑菌實驗 (1)菌懸液的制備。取活化好的菌株，挑取一至多個菌落放入盛有適量生理鹽水的無菌試管中，先用生理鹽水稀釋至1號麥?zhǔn)媳葷峁?約為3×108CFU/mL)濃度，再用生理鹽水稀釋得到1×108CFU/mL菌懸液。

(2)含藥平板的制備[8]和分組。①十一方藥酒組：取過濾除菌后的十一方藥酒原液用生理鹽水進行二倍法稀釋，配制成濃度為193 mg/mL、96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 25 mg/mL的系列應(yīng)用液。吸取各濃度應(yīng)用液2mL加入已融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基14mL，混合均勻后傾注于直徑90 mm的平板中，制成系列含十一方藥酒濃度分別為24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL的瓊脂平板，其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)分別為1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，接種菌液。②陰性對照組：只加等量十一方藥酒原液和營養(yǎng)瓊脂，不接種菌液。③溶劑對照組：不加十一方藥酒，只加等量的營養(yǎng)瓊脂和溶劑白酒各系列應(yīng)用液(將白酒用生理鹽水二倍稀釋)，得到稀釋倍數(shù)分別為1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的含白酒平板，接種菌液。

(3)菌液的接種。待上述瓊脂平板冷卻凝固后，將5種已配置好的菌懸液，吸取100 μL于瓊脂平板上均勻涂布，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察。

(4)MIC的測定。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各平板是否有菌生長。從無菌生長的平板中找出藥液濃度最低的平板，即該平板藥物濃度為十一方藥酒的MIC[9]。每種菌株平行實驗3次。

2.2.2 試管二倍稀釋法抑菌實驗 (1)菌懸液的制備。取活化好的菌株，挑取一至多個菌落放入盛有適量M-H肉湯的無菌試管中，先稀釋至1號麥?zhǔn)媳葷峁?約為3×108CFU/mL)濃度，再用M-H肉湯稀釋得到1×106CFU/mL的菌懸液。

(2)MBC的測定[10]。取滅菌具塞試管12支，依次編號為1～12。每支試管中先加入1 mL的無菌M-H肉湯，隨后在1號試管中加入已除菌的十一方藥酒1 mL，用無菌滴管吹打混勻，用移液槍吸取1 mL加入2號試管中，混勻后再吸取出1 mL加入3號試管，依此類推至第9管時，混勻后吸出1 mL棄去。1～9號試管的藥液濃度分別為96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL、0.377 0 mg/mL。以上1～9號試管均加入細(xì)菌近似濃度為1×106CFU/mL的菌懸液100 μL，充分混勻。第10號試管加入1 mL藥酒，混勻后吸出1 mL棄去，不加菌液，作為陰性對照，以便觀察受試藥液是否受污染。第11號試管加入1 mL白酒，混勻后吸出1 mL棄去，再加菌懸液100 μL，作為溶劑對照。第12號試管加入1 mL生理鹽水，混勻后吸出1 mL棄去，再加菌懸液100 μL，作為陽性對照(細(xì)菌生長對照)。所有樣品放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。由于十一方藥酒本身帶有顏色，并且由于劑型原因加入試管后各管均有一定混濁，為準(zhǔn)確判斷結(jié)果帶來一定難度。因此取每管液體50 μL轉(zhuǎn)種于瓊脂平板中，用無菌棉簽均勻涂布，37 ℃孵育18～24 h，以平板上未見細(xì)菌生長的試管所含最低藥物濃度為十一方藥酒的MBC。每種菌株平行實驗3次。

3 結(jié)果

3.1 瓊脂稀釋法抑菌實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，十一方藥酒對5種受試菌種有不同的最低抑菌濃度。十一方藥酒濃度≥6.031 3 mg/mL時，金黃色葡萄球菌平皿中無細(xì)菌生長；十一方藥酒濃度≥12.062 5 mg/mL時，銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的平皿中無細(xì)菌生長，結(jié)果見表1和圖1。溶劑白酒在各稀釋倍數(shù)的平板中均有菌落，結(jié)果見表2和圖2。因此，十一方藥酒對金黃色葡萄球菌的MIC為6.031 3 mg/mL，對銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的MIC為 12.062 5 mg/mL。

表1 瓊脂稀釋法測定十一方藥酒的抑菌效果

注：“-”表示沒有菌落；“+”表示有少量菌落；“++”表示有大量菌落。

3.2 試管二倍稀釋法抑菌實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，在陰性對照中，試管澄清，表明培養(yǎng)基和藥液無細(xì)菌污染。溶劑對照(白酒+菌液)的試管混濁，轉(zhuǎn)種瓊脂平板后有細(xì)菌生長，提示溶劑白酒無明顯抑菌作用。十一方藥酒在濃度≥12.062 5 mg/mL時，5種受試菌的試管內(nèi)液體轉(zhuǎn)種瓊脂平板后均未見各細(xì)菌生長。因此，十一方藥酒對5種受試菌的MBC均為12.062 5 mg/mL。結(jié)果見表3、圖3、圖4。

表2 瓊脂稀釋法測定溶劑白酒的抑菌效果

注：“-”表示沒有菌落;“+”表示有少量菌落;“++”表示有大量菌落。

圖1 瓊脂稀釋法中不同濃度的十一方藥酒的抑菌效果

圖2 瓊脂稀釋法中不同稀釋倍數(shù)的溶劑白酒的抑菌效果

4 討論

感染是骨科臨床常見疾病及手術(shù)并發(fā)癥。骨科患者由于開放性損傷、手術(shù)切口及手術(shù)植入物等易感因素的存在，常并發(fā)感染[11]。在骨科患者感染細(xì)菌菌群的分布中，以金黃色葡萄球菌、G-腸球菌、銅綠假單孢菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希菌等為主[11-13]。臨床研究表明，在全身支持療法的基礎(chǔ)上，以十一方酒濕敷治療未化膿感染型開放性骨折、十一方酒紗布和拔毒生肌膏交替外敷治療化膿感染型開放性骨折、術(shù)后用十一方酒淋濕傷面，患者的骨折愈合、創(chuàng)面愈合效果良好[3]。目前，十一方藥酒的抗菌、抗感染方面的實驗研究很少，限制了其推廣應(yīng)用。因此有必要深入系統(tǒng)地進行實驗研究，為十一方藥酒的應(yīng)用和開發(fā)提供實驗依據(jù)。

表3 試管二倍稀釋法測定十一方藥酒的抑菌效果

注：“-”表示試管無細(xì)菌生長;“+”表示試管有細(xì)菌生長。

圖3 試管二倍稀釋法中十一方藥酒的MBC測定結(jié)果

圖4 試管二倍稀釋法中溶劑白酒的試管轉(zhuǎn)種平皿后的結(jié)果

中藥體外抑菌實驗方法主要分為兩類：定性鑒別的抑菌環(huán)實驗、定量測定的稀釋法實驗[14]。其中抑菌環(huán)實驗操作簡便，但不夠準(zhǔn)確，敏感性較低，一般用于藥物初期的活性篩選；而稀釋法雖操作較為復(fù)雜，但稀釋法沒有中間載體，直接在培養(yǎng)基中反應(yīng)，不存在吸收和揮發(fā)的問題，因而能比較準(zhǔn)確地反映樣品的抑菌效果，定量評價該藥的抑菌性能[14]。在稀釋法中，又分為瓊脂稀釋法和液體稀釋法。瓊脂稀釋法通常把中藥加入瓊脂中做梯度稀釋，觀察細(xì)菌在藥液瓊脂中生長和疏密情況；液體稀釋法通常在試管中進行，采用肉眼觀察法(比濁法)來確定MIC。本研究預(yù)實驗采用抑菌環(huán)實驗(紙片法)時發(fā)現(xiàn)十一方藥酒的抑菌圈很小，而采用稀釋法進行實驗時卻具有抑菌效果，推測原因可能為：其一，由于十一方藥酒原液的生藥濃度不高，無法達到紙片法的有效抑菌濃度；其二，十一方藥酒的抑菌物質(zhì)不容易由濾紙片擴散進入瓊脂。因此，本實驗采用稀釋法進行十一方藥酒的抑菌效果評價。

實驗選擇了有代表性的實驗微生物來評價十一方藥酒的抑菌活性。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是G+菌的代表菌種，是骨科創(chuàng)面感染的常見細(xì)菌[12]；銅綠假單胞菌是是一種抗性較強的G-細(xì)菌，是骨科開放骨折感染創(chuàng)面常見致病菌[12]；乙型副傷寒沙門菌是G-細(xì)菌，白色念珠菌為真菌。瓊脂稀釋法顯示：十一方藥酒對金黃色葡萄球菌的MIC為6.031 3 mg/mL，對銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的MIC為 12.062 5 mg/mL。試管二倍稀釋法顯示：十一方藥酒對5種受試菌的MBC均為12.062 5 mg/mL。綜合兩種抑菌實驗方法的結(jié)果，十一方藥酒在體外對5種供試菌均有抑菌活性。

由于十一方藥酒的溶劑為白酒，因此，實驗中用白酒作為溶劑對照。白酒中含有乙醇，一般認(rèn)為，乙醇能溶解細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜中的類脂，破壞膜結(jié)構(gòu)并使蛋白質(zhì)變性，體積濃度70%時滅菌力最強，效果最好[15]。本實驗顯示，白酒在瓊脂稀釋法中做1∶8倍稀釋，試管二倍稀釋法中做1∶2倍稀釋，5種受試菌均有菌生長，無法達到MIC，說明溶劑白酒的抑菌作用非常微弱，十一方藥酒的抑菌作用來源于藥物自身存在的抑菌成分。本實驗的結(jié)果和文獻[16]報道的結(jié)果有所不同，推測原因可能與不同實驗選擇的溶劑對照不同以及十一方藥酒的制劑工藝不同有關(guān)。

綜上，十一方藥酒體外對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌有抑菌活性。本研究為十一方藥酒的功能活性提供了參考，也為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。十一方藥酒在疾病動物模型中的抑菌作用，以及其抑菌的有效成分，還有待進一步研究。