探討PCR 技術(shù)于檢驗(yàn)沙門菌中的應(yīng)用與進(jìn)展

王小東

（四川省成都市青白江區(qū)疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610300）

0 引言

沙門菌是常見的革蘭氏陰性菌，隸屬腸道細(xì)菌科，會(huì)誘發(fā)多種血清感染，進(jìn)而導(dǎo)致沙門菌病。沙門菌屬于中毒病菌的一種，若誤食發(fā)霉食物則會(huì)導(dǎo)致沙門菌中毒，且中毒食物多為蛋奶類與肉類。以上畜牧產(chǎn)品的營養(yǎng)元素豐富，會(huì)為沙門菌生長與繁殖提供便利條件。此外，沙門菌具有較強(qiáng)的生命力，其適應(yīng)能力強(qiáng)，可在食物中存活數(shù)月。沙門菌所致的食物中毒可使牲畜以及人類共同患病，具有較強(qiáng)的傳播性。沙門菌的常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)為血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，其檢驗(yàn)周期長，檢驗(yàn)流程過于繁瑣，所以需要尋求高效且快速的新技術(shù)。在生物學(xué)技術(shù)的推動(dòng)下，PCR技術(shù)得到廣泛使用，其可以對(duì)沙門菌進(jìn)行定量和定性檢驗(yàn)，具有較完善的快速檢驗(yàn)體系，檢驗(yàn)敏感度高。

1 沙門菌概述

沙門菌主要依附在消化系統(tǒng)內(nèi)，其抗原構(gòu)成類似于革蘭陰性桿菌，是消化系統(tǒng)疾病的主要致病菌[1]。沙門菌所導(dǎo)致的疾病主要有兩類，第一類為急性腸胃炎，第二類為傷寒、副傷寒。有研究指出，因沙門菌誘發(fā)食物中毒的患者數(shù)量在我國食物中毒總?cè)藬?shù)中居于首位，其為食物中毒最常見的細(xì)菌[2]。在食物中毒類別中，肉類的沙門菌含量最高，原因是其營養(yǎng)元素多，可促進(jìn)沙門菌繁衍。若食物中所攜帶的沙門菌達(dá)到一定數(shù)量，則會(huì)造成人體感染。因此，感染的主要方式為食用沙門菌所污染的食物。

2 沙門菌常用檢驗(yàn)技術(shù)

感染沙門菌后，需要采集被感染者的血液或者排泄物，而后將其作為樣本進(jìn)行致病菌檢驗(yàn)[3]。臨床病料以及食物安全檢測(cè)的本質(zhì)原理基本一致，但食物安全檢測(cè)的制約因素較多，可能因食物本身的物質(zhì)構(gòu)成影響檢驗(yàn)準(zhǔn)確率，且食物可能受到多種致病菌侵襲，或是食物通過人工處理被外界因素影響，這都會(huì)損傷沙門菌，也可能導(dǎo)致沙門菌死亡，進(jìn)而干擾檢驗(yàn)結(jié)果。此外，臨床病料內(nèi)的沙門菌含量與食物安全檢測(cè)樣本中的含量有所差別，臨床病料含量遠(yuǎn)高于食物含量。常規(guī)檢驗(yàn)方法需要提取被感染對(duì)象的體內(nèi)表面抗原，利用生化反應(yīng)等途徑檢出沙門菌，其反應(yīng)過程比較繁瑣，檢驗(yàn)所需時(shí)間長，需要大量使用反應(yīng)試劑，且檢驗(yàn)靈敏度不高[4]。相比較而言，PCR技術(shù)是對(duì)常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)的優(yōu)化，可以縮短檢驗(yàn)時(shí)間，精準(zhǔn)檢出目的基因的致病菌種類，實(shí)現(xiàn)快速檢驗(yàn)。目前，PCR技術(shù)在沙門菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用率較高，且檢驗(yàn)效果備受認(rèn)可。

3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pol ymer ase chain r eaction，PCR）檢驗(yàn)技術(shù)概述

PCR技術(shù)的檢驗(yàn)原理是采集特定DNA片段，利用PCR技術(shù)將DNA片段進(jìn)行放大，即循環(huán)復(fù)制所提取的DNA片段，使少量DNA可以不斷增多，最終檢出致病菌。簡而言之，DNA樣本復(fù)制是PCR檢驗(yàn)的核心特征。其檢驗(yàn)過程是將單鏈DNA作為檢驗(yàn)樣本，在特定環(huán)境條件下，引物選擇人工合成品，通過PCR技術(shù)增加樣本數(shù)量。具體細(xì)分為如下3個(gè)步驟：①高溫變性；②低溫復(fù)性；③適溫延伸。將以上步驟視作一個(gè)單位，以循環(huán)方式完成檢驗(yàn)操作。在PCR實(shí)驗(yàn)期間，需要高度關(guān)注溫度變化，原因是溫度不適宜會(huì)使樣本DNA中的聚合酶活性喪失，進(jìn)而影響檢驗(yàn)結(jié)果。因此，每次循環(huán)均需要予以補(bǔ)充、增活操作，保證檢驗(yàn)結(jié)果有效。但PCR技術(shù)存在不足之處，如檢驗(yàn)效率受人為因素制約，若操作人員技能有限，儀器參數(shù)調(diào)節(jié)不當(dāng)則會(huì)降低檢驗(yàn)精準(zhǔn)度。PCR檢驗(yàn)需要使用PCR儀器，其根據(jù)聚合酶衍生而來，可以合理控制檢驗(yàn)溫度，進(jìn)而對(duì)DNA樣本完成檢驗(yàn)。PCR技術(shù)的典型特點(diǎn)是敏感度與特異度強(qiáng)，可精準(zhǔn)且快速檢驗(yàn)，且有較高的自動(dòng)化程度。由于PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢驗(yàn)，因此被積極用于多個(gè)領(lǐng)域，且在實(shí)際運(yùn)用中整合多項(xiàng)技術(shù)，進(jìn)而衍生出多種PCR檢驗(yàn)技術(shù)。

4 PCR檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)于沙門菌的檢測(cè)應(yīng)用

4.1 常規(guī)PCR技術(shù)

常規(guī)PCR技術(shù)在設(shè)計(jì)引物時(shí)選擇特定DNA目標(biāo)樣本，采取特異保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以擴(kuò)增待檢DNA樣本，利用終產(chǎn)物的擴(kuò)增反應(yīng)定性或者定量分析樣本，其檢驗(yàn)敏感度較高，便于操作，檢驗(yàn)難度一般[5]。但其存在檢驗(yàn)不足，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，或者引物不同也會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的問題。所以，常規(guī)PCR技術(shù)需要進(jìn)行專業(yè)且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z驗(yàn)操作，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)開展檢驗(yàn)工作，規(guī)避檢驗(yàn)影響因素。在常規(guī)PCR檢驗(yàn)時(shí)，可將沙門氏菌毒力基因（hilA）作為檢驗(yàn)引物，擴(kuò)增片段選擇497by，可明顯縮短檢驗(yàn)耗時(shí)，同時(shí)可以保證檢驗(yàn)敏感度與準(zhǔn)確率。也可將沙門菌屬（inv A）基因作為目的基因，經(jīng)PCR檢驗(yàn)48h后可獲取檢驗(yàn)結(jié)果。研究樣品選擇加工雞肉或者生肉，在樣品上人工培養(yǎng)沙門菌，此時(shí)的PCR檢驗(yàn)結(jié)果與BAx（r）系統(tǒng)的檢驗(yàn)結(jié)果基本一致，準(zhǔn)確率可達(dá)99%以上。雖然常規(guī)PCR的檢驗(yàn)速度快，可操作性強(qiáng)，但難以區(qū)分細(xì)菌有無活性，進(jìn)而降低食物中毒的檢出率。原因是活性細(xì)菌被認(rèn)為是食物中毒的主要致病菌，檢出活性細(xì)菌可以綜合判斷沙門菌感染情況。此外，常規(guī)PCR技術(shù)容易出現(xiàn)樣本污染情況，進(jìn)而影響致病菌檢出效果。不過目前PCR檢驗(yàn)技術(shù)水平提升，可以消除污染因素。

4.2 多重PCR技術(shù)

相比于常規(guī)PCR技術(shù)，多重PCR的優(yōu)勢(shì)為將1對(duì)引物增多至2對(duì)及以上，能夠強(qiáng)化DNA反應(yīng)。多重PCR技術(shù)與常規(guī)PCR的檢驗(yàn)一致性較高，更具高效性和便利性，且檢驗(yàn)成本低。多重PCR技術(shù)被廣泛用于沙門菌等檢驗(yàn)工作中，可增快檢驗(yàn)速度。但其同樣具有檢驗(yàn)劣勢(shì)，如檢驗(yàn)效率一般、敏感度不高等。因此，多重PCR技術(shù)需要突破現(xiàn)階段的檢驗(yàn)條件，優(yōu)化排查檢驗(yàn)影響因素，進(jìn)而建立PCR反應(yīng)體系。李師瑩等[6]研究中，鑒定沙門菌血清型，選擇鼠傷寒沙門菌（Stm4495）、inv A和雞白痢沙門菌（SPUL-2693）作為引物，通過標(biāo)準(zhǔn)菌株-優(yōu)化體系建立四重PCR檢驗(yàn)流程。結(jié)果可見四重PCR的敏感度與特異度較佳，能夠檢出以上3種沙門菌，為快速檢驗(yàn)提供新型技術(shù)支持。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）

FQ-PCR技術(shù)最早于1996年被提出，是在常規(guī)的PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號(hào)實(shí)時(shí)評(píng)估PCR技術(shù)的反應(yīng)過程。該技術(shù)是指對(duì)目的基因以及標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，而后完成致病菌檢驗(yàn)操作。該技術(shù)從常規(guī)PCR的定性檢驗(yàn)延伸至定性、定量同時(shí)檢驗(yàn)，其優(yōu)勢(shì)為減少PCR標(biāo)本受污染的情況，具有更高的檢驗(yàn)特異度和自動(dòng)化程度，是現(xiàn)階段沙門菌檢驗(yàn)的常用技術(shù)。此外，F(xiàn)Q-PCR的優(yōu)勢(shì)之一為多種抗原聯(lián)合檢驗(yàn)，可將VI抗原基因或者H抗原基因等多種抗原作為引物，以PCR擴(kuò)增方式檢驗(yàn)傷寒沙門菌，其對(duì)于基因擴(kuò)增的敏感度高，可以明顯提升傷寒疾病的檢出率，進(jìn)而指導(dǎo)醫(yī)生疾病的早期診斷與治療工作。FQ-PCR技術(shù)可以有效且快速地檢出特定樣本內(nèi)的沙門菌，其敏感度可達(dá)10cfu/g，檢驗(yàn)時(shí)間約是4-10h，且獲得的檢驗(yàn)結(jié)果比較精準(zhǔn)。以往研究將實(shí)驗(yàn)細(xì)菌或者食物作為目標(biāo)樣本，利用FQPCR技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其檢驗(yàn)敏感度達(dá)到102cfu/ml，結(jié)果獲取時(shí)間在24h內(nèi)，說明FQPCR技術(shù)使得沙門菌檢驗(yàn)手段更具科學(xué)性和專業(yè)性。目前，相關(guān)研究細(xì)致分析FQ-PCR檢驗(yàn)所需環(huán)境條件和FQ-PCR技術(shù)特征，通過編碼方式確定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，并整合實(shí)驗(yàn)引物需求，進(jìn)而建立新型檢驗(yàn)方法，證實(shí)通過其他物質(zhì)性質(zhì)的分析，能夠反映沙門菌特征，而適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度可以有效識(shí)別細(xì)菌種類?；谝陨霞夹g(shù)前提，使用FQ-PCR技術(shù)檢驗(yàn)畜牧產(chǎn)品中的沙門菌含量，通過對(duì)兩種肉類樣本的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Q-PCR的檢驗(yàn)敏感度約是12cfu/25g，檢驗(yàn)周期在10h內(nèi)，且檢驗(yàn)流程快捷、便利，具有較高的檢驗(yàn)特異度。但需注意的是，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)的成本較高，對(duì)于檢驗(yàn)設(shè)備的功能要求較高，這是影響其推廣使用的制約性因素之一。田賽[7]研究中通過FQ-PCR技術(shù)檢驗(yàn)沙門菌，樣本選擇海鮮與糞便，結(jié)合omp F基因序列科學(xué)化設(shè)計(jì)引物，建立FQ-PCR檢驗(yàn)方法，并分析該技術(shù)的敏感度、特異度與穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)能夠擴(kuò)增沙門菌多個(gè)型別的基因組DNA，不擴(kuò)增非沙門菌病菌的基因組DNA，特異度良好。其對(duì)于陽性質(zhì)粒模板的實(shí)際敏感度是0.1ng/L，而對(duì)于菌株基因組DNA的實(shí)際敏感度是10CFU/ml，能夠在短時(shí)間檢出沙門菌陽性菌株。此外，F(xiàn)Q-PCR的重復(fù)性比較強(qiáng)，經(jīng)過5次反復(fù)試驗(yàn)后，Ct值變異系數(shù)不超過0.8%，證明FQ-PCR技術(shù)的敏感度、特異度高，且有良好穩(wěn)定性，可以用于沙門菌的相關(guān)檢驗(yàn)工作。

4.4 免疫捕捉PCR技術(shù)

免疫捕捉PCR是將PCR擴(kuò)增技術(shù)有效整合于免疫捕捉技術(shù)，其檢驗(yàn)對(duì)象是病原體，利用特異抗體有效捕捉抗原微生物，而后通過基因組序列引物開展PCR擴(kuò)增操作，再通過檢測(cè)擴(kuò)增后的產(chǎn)物能夠分析完整病原體信息，進(jìn)而保證檢驗(yàn)特異度。此外，在免疫捕捉與擴(kuò)增過程中，樣本體積會(huì)有所擴(kuò)大，因此檢驗(yàn)敏感度會(huì)隨之提升。該技術(shù)可細(xì)分成以下步驟：第一，抗體固相化，在微量滴定板、瓊脂糖凝膠顆?；蛘遝p p end orf管等固相載體表面包被特異抗體。第二，抗原捕捉，孵育樣本和所包被的抗體，使其能夠吸附抗原微生物，進(jìn)而完成抗原捕捉操作。第三，制備模板，利用加熱的方式促使DNA病毒釋放出基因組DNA，利用逆轉(zhuǎn)錄制形式釋放RNA病毒的基因組RAN，將c DNA用作模板。第四，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)借助特異引物完成，可以使用內(nèi)外兩對(duì)引物，通過套式PCR完成擴(kuò)增操作，以此保證檢驗(yàn)特異度。第五，檢測(cè)擴(kuò)增物，使用寡核苷酸探針以及瓊脂糖凝膠電泳雜交等多種形式進(jìn)行檢驗(yàn)，分析擴(kuò)增片段的序列。免疫捕捉技術(shù)具有操作簡單且檢驗(yàn)快速的優(yōu)勢(shì)，能夠基本滿足大規(guī)模樣本的篩選需求，可以在短時(shí)間內(nèi)檢出樣本中的沙門菌含量，可用于商品檢驗(yàn)檢疫、食品衛(wèi)生檢測(cè)、臨床疾病診斷等多個(gè)領(lǐng)域。

4.5 免疫磁珠分離PCR（immunomagnetic bead separation PCR，IMS-PCR）技術(shù)

IMS-PCR最早于2009年被用于沙門菌的檢驗(yàn)工作中，其操作便利性強(qiáng)，檢驗(yàn)時(shí)間短，對(duì)于沙門菌的檢出率高。IMS-PCR對(duì)于牛乳沙門菌的檢驗(yàn)敏感度約是9cfu/ml，檢驗(yàn)時(shí)間約是7h，能夠顯著提升沙門菌檢驗(yàn)的時(shí)效性以及敏感度。IMS-PCR需對(duì)目標(biāo)菌抗體與磁珠間進(jìn)行包被處理，進(jìn)而獲得免疫磁珠，再結(jié)合于樣本內(nèi)目標(biāo)菌的抗原抗體，最后通過磁場(chǎng)作用使食物基質(zhì)內(nèi)的目標(biāo)菌被有效分離。該技術(shù)是對(duì)FQ-PCR以及免疫磁珠分離的高效整合，同時(shí)具備以上兩種技術(shù)的檢驗(yàn)優(yōu)勢(shì)，對(duì)于沙門菌的檢驗(yàn)速度更快，準(zhǔn)確度更高。但食物基質(zhì)具有較高的復(fù)雜性，且食物種類不同，其檢驗(yàn)條件以及食源性致病菌分布有所差異，需要合理選擇檢驗(yàn)方法，可以針對(duì)性開展檢驗(yàn)工作，所以其檢驗(yàn)技術(shù)要求高?，F(xiàn)階段，免疫磁珠分離FQ-PCR技術(shù)的使用范圍較廣，被用于雞胸肉、豬肉以及牛奶等食物沙門菌檢驗(yàn)工作中。目前，檢驗(yàn)過程中不斷優(yōu)化免疫磁珠使用量和樣本菌液具體的反應(yīng)時(shí)間，選取典型性的沙門菌，可以提高免疫磁珠的檢驗(yàn)特異度，增強(qiáng)其捕獲能力。此外，將ttr沙門菌基因作為靶基因，有效構(gòu)建FQ-PCR體系能夠優(yōu)化沙門菌免疫磁珠分離FQ-PCR檢驗(yàn)技術(shù)，顯著縮短檢驗(yàn)所需時(shí)間，是沙門菌檢驗(yàn)的高效手段。李亞茹等[8]研究中采取免疫磁珠分離聯(lián)合FQ-PCR檢驗(yàn)技術(shù)，對(duì)蝦中的沙門菌進(jìn)行檢驗(yàn)，免疫磁珠由抗沙門菌多克隆抗體以及納米磁珠進(jìn)行制備，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行適度優(yōu)化，利用Ⅱ訂S法進(jìn)行檢驗(yàn)，引物為沙門菌舸基因，建立檢驗(yàn)體系。選擇沙門菌4株進(jìn)行檢驗(yàn)，評(píng)估敏感度與特異度。結(jié)果可見免疫磁珠添加量的最合理用量是100皿，樣本菌液以及免疫磁珠的反應(yīng)最佳時(shí)間是30min，該技術(shù)對(duì)于蝦內(nèi)部沙門菌的檢出率高，檢驗(yàn)時(shí)間短于6h。證實(shí)免疫磁珠分離聯(lián)合FQ-PCR能夠預(yù)防沙門菌所致的食源性疾病，在沙門菌檢驗(yàn)中的可行性高。

綜上，在沙門菌檢驗(yàn)技術(shù)中，PCR技術(shù)的操作便利，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確且高效[9-13]，是現(xiàn)階段應(yīng)用比較廣泛的檢驗(yàn)技術(shù)之一。相比于常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)，PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)明顯，尤其是FQPCR、免疫捕捉PCR技術(shù)與IMS-PCR技術(shù)不僅能縮短檢驗(yàn)耗時(shí)，還能提升檢驗(yàn)準(zhǔn)確度。雖然以上PCR檢驗(yàn)技術(shù)仍存在不足之處，但其在衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)以及多種疾病的臨床診斷中占據(jù)重要地位。在未來研究中，可積極引入新技術(shù)與先進(jìn)科技，不斷優(yōu)化PCR對(duì)于沙門菌的檢驗(yàn)技術(shù)[14-16]，并突破PCR檢驗(yàn)過程中的環(huán)境條件約束，提高PCR技術(shù)的適用性。