葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞檢測對早期肺癌的診斷價值

陳鵬飛 謝金標 楊天寶 王 武 陳 豪 黃國忠

莆田學院附屬醫(yī)院心胸外科，福建莆田 351100

據(jù)中國國家癌癥中心（ChinaNationalCancerCenter，NCC）公布的最新癌癥數(shù)據(jù)[1]，我國常見的癌癥類型包括肺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占比超過總癌癥類型的50%。肺癌是中國最常見的癌癥，如果在早期發(fā)現(xiàn)并進行手術切除，預后良好，5 年生存率達到70%～90%。然而，大多數(shù)患者（約75%）在確診時已是晚期（Ⅲ/Ⅳ期）[2]。因此，對肺癌患者盡早實施診斷和治療對患者的預后尤為關鍵。目前，肺部結節(jié)良、惡性的臨床診斷方法是血液學檢測（腫瘤標志物）、影像學檢查（胸部CT）等。其中，化驗腫瘤標志物的指標在肺癌和癌前病變中，癌胚抗原、腫瘤相關糖類抗原、細胞角蛋白片段等的表達率均不高，從而對臨床診斷的準確性產生一定的影響。影像學檢查如發(fā)現(xiàn)肺部小結節(jié)，患者對手術治療的態(tài)度不明確，未能按時治療，患者常常會錯失最佳手術時機[3]。循環(huán)腫瘤細胞為患者機體的腫瘤細胞自發(fā)從原發(fā)腫瘤和轉移灶或者侵入性操作導致釋放入血，腫瘤細胞在循環(huán)中聚集，形成微小的瘤栓，在適宜條件下形成轉移灶[4]。葉酸受體在肺癌細胞中表達率高，本研究探討早期肺癌患者葉酸受體陽性的臨床療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年9 月至2021 年12 月莆田學院附屬醫(yī)院收治的100 例疑似肺癌患者作為研究對象，其中男57 例，女43 例；年齡44～79 歲，平均（62.16±2.51）歲。納入標準：①臨床表現(xiàn)不典型，只有咳嗽、胸悶、低熱等呼吸道表現(xiàn)，胸部CT 表現(xiàn)為疑似肺癌的單一肺結節(jié)（最大直徑＜3 cm），沒有縱隔淋巴結腫大或其他轉移；②所有患者知情且自愿參與本研究，臨床資料完整。排除標準：①CT 顯示肺部多個結節(jié)，并伴發(fā)轉移；②包括外科和放射治療患者，或者是肺部腫瘤復發(fā)患者[5]。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意（2019090），患者和家屬均簽署研究知情同意書。

1.2 方法

所有患者抽取3 ml 肘前靜脈血，含有EDTA 的試管用于靜脈血的保存，儲存溫度：4℃，檢測時間：葉酸受體陽性的循環(huán)腫瘤細胞檢測在24 h 后進行。首先采用3 ml 血液中的免疫磁性微球負向富集方法，采用配體PCR 技術對其進行定量檢測，上海格諾思博生物技術有限公司為其提供的檢測試劑盒，并嚴格按照試驗試劑盒的使用方法進行操作[6]，用4 倍于3 ml 的紅細胞溶解液，于4℃溶解15 min，除去紅細胞，再加入150 μl 抗CD45 微球，于4℃培養(yǎng)30 min，除去白細胞；將抗CD14 微粒50 μl 于4℃培養(yǎng)30 min，將巨噬細胞剔除；將采集到的循環(huán)腫瘤細胞添加10 μl的具有腫瘤特異性的葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標記液，在室溫孵育40 min，然后添加1 ml 的清洗緩沖溶液，在4℃下進行10 min 的離心，以1500 r/min 的速度，離心半徑15 cm，反復3 次，以除去未結合的探頭；最后，添加120 μl 的洗脫緩沖溶液，4℃培養(yǎng)2 min，將結合的探頭洗脫出來，離心收集，加入中和緩沖液24 μl，進行熒光PCR 擴增，利用ABI7300 儀器（美國愛普拜斯公司）采集PCR 信號和數(shù)據(jù)[7-8]。在此基礎上，ABI7300 儀器在95℃變性2 min、40℃退火30 s、72℃延長30 s、8℃5 min 完成；40 次熱處理后，95℃變性10 s、35℃退火30 s、72℃延伸10 s。在3 ml 的血液中，發(fā)現(xiàn)1 個循環(huán)中的葉酸受體陽性細胞，即1 FU[9]。

1.3 觀察指標

記錄100 例患者中的早期肺癌、肺良性結節(jié)患者的例數(shù)，葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)及該檢測方法在臨床診斷的靈敏度、特異度。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并采用Kappa 一致性檢驗分析診斷價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 早期肺癌患者和肺良性病變患者葉酸受體陽性腫瘤細胞的比較

結合患者的病理診斷結果，有75 例早期肺癌患者，25 例肺良性病變患者，早期肺癌患者的葉酸受體陽性腫瘤細胞為（11.38±1.37）FU/3 ml，高于肺良性病變患者的（8.10±1.83）FU/3 ml，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.495，P＜0.05）。

2.2 葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞檢測診斷早期肺癌的價值

以術后病理結果作為診斷肺癌的金標準，Kappa一致性檢驗顯示葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤診斷早期肺癌具有一定的準確性（Kappa=0.683，P＜0.05）；以葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞作為肺癌的診斷指標，ROC曲線下面積為0.810（95%CI=0.648～1.000），最佳截斷值為8.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%（圖1）。

圖1 葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞檢測診斷價值的ROC 曲線

3 討論

肺癌患者的人數(shù)越來越多，病情嚴重，具有很高的死亡率，嚴重威脅患者的生命安全。因此，對肺癌患者做到早診斷和早治療尤為重要。隨著居民對體檢意識認知性的提高，肺結節(jié)的臨床診斷率越來越高，但結節(jié)的性質、能否手術影響著患者及家屬的決定[10]。

腫瘤標記物在早期肺癌的診斷中，臨床參考價值較小，診斷意義不大。而外周血中腫瘤細胞的檢測在臨床上也有一定的局限性，目前，尚沒有一種標準的方法來進行檢測[11]。早期的循環(huán)腫瘤細胞可以顯示出腫瘤細胞的形狀，而循環(huán)腫瘤細胞的檢測則是基于不同的細胞形態(tài)，對腫瘤各項數(shù)據(jù)進行分析，而不需要對細胞表面的信息進行檢測，其優(yōu)勢在于不依賴于循環(huán)中的腫瘤細胞表面抗原，且其形態(tài)和活性保持不變，但其純度非常低，容易失去直徑較小的循環(huán)腫瘤細胞[12-14]。

葉酸受體在肺癌細胞的表達性很高，因此，葉酸受體陽性的循環(huán)腫瘤細胞檢測是最理想的檢測手段。通過保真放大、實時檢測PCR 分子，實現(xiàn)雙層次放大，最終完成對3 ml 血液樣本中循環(huán)腫瘤細胞的檢測，對檢測的靈敏度有很大的改善[15]。在本研究中，通過對100 例疑似肺癌患者實施檢測，比較早期肺癌的臨床診斷中早期肺癌及良性肺結節(jié)患者的葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞，結果顯示，葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞更高，早期肺癌患者的葉酸受體陽性腫瘤細胞含量高于肺良性病變細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.495，P＜0.05），同時檢測Kappa 值為0.683，AUC為0.810，最佳截斷值為8.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%，具有一定的臨床診斷價值。本研究結果與唐興等[16]的研究結果一致，具有參考價值。

綜上所述，葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞在早期肺癌的臨床診斷中靈敏度較高，能夠作為診斷早期肺癌的有效標記物，明確肺癌患者的具體情況，在臨床上具有較高的應用價值，值得臨床推廣應用。