內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展

張 毅，張 強(qiáng)，曹 亮，羅張榮，李 青

脊髓損傷(SCI)是一種嚴(yán)重的、高度致殘的、致命的一種疾病，多由意外事故引起[1]。在SCI中，初始機(jī)械作用引起的原發(fā)性損傷存在不可逆的神經(jīng)細(xì)胞死亡，繼而在炎癥、局部缺血、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞凋亡等多種因素作用下導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，最終造成軸突束斷裂，引起運(yùn)動(dòng)或感覺功能障礙[2-3]。目前仍未找到有效的SCI治療方法。當(dāng)前SCI治療主要集中在以下2個(gè)方面[4-5]，一方面是神經(jīng)保護(hù)，通過減少或消除繼發(fā)性病理反應(yīng)以保護(hù)殘留軸突和神經(jīng)細(xì)胞，如服用類固醇藥物[6]、托吡酯[7]、尼莫地平等；另一方面是神經(jīng)再生和修復(fù)，通過促進(jìn)神經(jīng)元再生和重建突觸連接，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)[8]治療、基因治療和神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)治療[9]。NSCs療法被認(rèn)為是治療SCI最有前景的方法[10]。NSCs主要存在于成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的腦和脊髓中[11-12]。NSCs在正常生理?xiàng)l件下保持靜止，在CNS損傷等條件下可以被激活[13]。激活的NSCs可以自我更新以維持干細(xì)胞庫并分化為用于組織修復(fù)的神經(jīng)細(xì)胞。大量研究表明，神經(jīng)元的病理性凋亡是SCI繼發(fā)性損傷的主要病理基礎(chǔ)[14]，適當(dāng)誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(ENSCs)增殖分化為神經(jīng)元以補(bǔ)償神經(jīng)元的損失，是減少病理損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)SCI的有效方法[15-16]。在此我們總結(jié)了ENSCs的特征、在SCI治療中的意義及相關(guān)進(jìn)展。

1 脊髓ENSCs的來源

在成人大腦和脊髓中發(fā)現(xiàn)了NSCs的存在，證明了CNS可能具有通過新生神經(jīng)元修復(fù)損傷的潛力[11]。NSCs是CNS中的原始細(xì)胞，具有自我更新和多向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛力。在創(chuàng)傷性腦損傷等病理?xiàng)l件下，NSCs的增殖和神經(jīng)發(fā)生增加。這些新生成的神經(jīng)細(xì)胞有能力遷移到損傷部位并替換受損神經(jīng)元[17]。

在脊髓中，沿中央管排列的室管膜細(xì)胞具有體外分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力，它們被定義為NSCs[18]。室管膜細(xì)胞(CD133+/FoxJ1+)、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(NG2+/OLIG2+)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+/Sox9+/Cx30+)均曾被研究者認(rèn)為是脊髓干細(xì)胞[19]。在完整的脊髓中，室管膜細(xì)胞很少分裂，但在細(xì)胞培養(yǎng)中，室管膜細(xì)胞開始劇烈分裂，并通過產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，表現(xiàn)出多能性[20]。SCI后，室管膜細(xì)胞開始快速分裂，并在膠質(zhì)瘢痕中生成超過一半的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，使軸突髓鞘化[20]。少突膠質(zhì)祖細(xì)胞是成人完整脊髓中主要的分裂細(xì)胞群，它們?cè)赟CI后加速分裂，并產(chǎn)生大量的髓鞘化少突膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞在完整的脊髓內(nèi)偶爾分裂以維持其數(shù)量。損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速分裂，形成膠質(zhì)瘢痕的邊界[20-21]。星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)祖細(xì)胞能夠自我更新，但其不是多能細(xì)胞，這表明它們不是干細(xì)胞[20]。然而，室管膜細(xì)胞在培養(yǎng)中和SCI后通過生成新的室管膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞而顯示出NSCs特性。因此，室管膜細(xì)胞代表了成人脊髓中潛在的神經(jīng)干細(xì)胞群[22]。

1.1中央管內(nèi)的脊髓NSCs 襯在中央管內(nèi)的室管膜層被稱為脊髓NSC微環(huán)境。在小鼠脊髓中，室管膜細(xì)胞起源于中期胚胎階段(E15.5)，出生時(shí)完全包圍中央管[23]。根據(jù)對(duì)FoxJ1-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)室管膜細(xì)胞可分為3種基本類型：立方室管膜細(xì)胞、長(zhǎng)柄細(xì)胞和放射狀室管膜細(xì)胞[19]。立方室管膜細(xì)胞是最豐富的多纖毛細(xì)胞，而放射狀室管膜細(xì)胞是數(shù)量較少的類型[24]。此外，在NSC微環(huán)境中還存在另一種細(xì)胞類型，即腦脊液-接觸神經(jīng)元(CSF-CNs)[25]，這些細(xì)胞主要分布在脊髓中央管的室管膜層、脊髓周圍的實(shí)質(zhì)及中腦和橋連接處的中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)[26]。這些細(xì)胞的一側(cè)突出與腦脊液連接，而另一側(cè)與脊髓實(shí)質(zhì)連接，從而形成“腦-腦脊液屏障”。CALLE等[27]也證實(shí)了CSF-CNs有2種信號(hào)傳遞方式：一種是通過突觸通訊，另一種是通過細(xì)胞間液體腦脊液介導(dǎo)的化學(xué)信號(hào)傳遞。最近的研究結(jié)果表明，CSF-CNs影響內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞的表達(dá)和SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)，并證實(shí)了PKD2L1+ CSF-CNs在體外具有NSCs的特性[28-29]。

1.2脊髓中央管室管膜細(xì)胞的異質(zhì)性 研究表明，室管膜細(xì)胞具有異質(zhì)性[30]。巢蛋白在室管膜細(xì)胞的背側(cè)和腹極表達(dá)，而CD15和BLBP在背側(cè)區(qū)域表達(dá)[18]。在成年小鼠脊髓中，含有巢蛋白的細(xì)胞數(shù)量以頸椎最多，胸椎次之，腰椎最少[31]。

2 脊髓ENSCs損傷后的反應(yīng)

研究表明，NSCs在正常情況下保持靜止?fàn)顟B(tài)或增殖非常緩慢，SCI會(huì)誘導(dǎo)脊髓ENSCs的激活[32]，并增殖、遷移至受損部位分化，參與組織的修復(fù)。因此，了解影響ENSCs激活的機(jī)制對(duì)SCI治療有重大意義。

2.1脊髓ENSCs的活化和增殖 內(nèi)環(huán)境變化是影響ENSCs活化、增殖的主要因素，如可溶性因子、血管破壞導(dǎo)致的缺氧及免疫反應(yīng)的增加，可能有助于CNS損傷后NSC的活化[32-33]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、BDNF等生長(zhǎng)因子在NSCs的激活中也發(fā)揮重要作用[34-35]。HAN等[36]通過條件性基因敲除方法發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠通過激活ERK通路和AKT通路促進(jìn)NSCs的活化、增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，bFGF可激活NSCs，促進(jìn)其增殖分化為少突膠質(zhì)祖細(xì)胞，增加腦實(shí)質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[37]。ZHANG等[38]將表達(dá)bFGF的NSCs移植到CNS損傷大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)bFGF能促進(jìn)梗死區(qū)NSCs增殖、分化為成熟神經(jīng)元。SCI后反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的BDNF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、NGF和bFGF可促進(jìn)血管重建，修復(fù)腦屏障，減輕水腫并阻止炎性細(xì)胞的擴(kuò)散[16]。此外，還有研究表明，SCI激活免疫細(xì)胞觸發(fā)多種促炎和抗炎細(xì)胞因子的釋放，具有神經(jīng)損傷與神經(jīng)保護(hù)的雙重效果[39]。小鼠ENSCs與促炎M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可上調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和白細(xì)胞介素(IL)-1β表達(dá)，并通過MAPK/Sox2信號(hào)通路促進(jìn)其增殖，而與抗炎M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)則誘導(dǎo)精氨酸酶和IL-10表達(dá)的上調(diào)，抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)向神經(jīng)元分化[40]。

2.2脊髓ENSCs的遷移 SCI后3 d可以檢測(cè)到激活的ENSCs從中央管向病變部位遷移[19]。遷移的細(xì)胞會(huì)改變它們的形態(tài)并失去FoxJ1、Sox2和Sox3的表達(dá)[19]。報(bào)告顯示，病變部位募集的NSCs主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在較小程度上分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，但在損傷后不分化為神經(jīng)元[19]。研究發(fā)現(xiàn)，炎性刺激物如干擾素-γ(IFN-γ)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞合成趨化因子、細(xì)胞因子參與NSCs的遷移[41]。趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)可趨化成年NSCs發(fā)生遷移，干細(xì)胞因子可趨化Nestin未分化細(xì)胞的遷移[42-43]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)能促進(jìn)NSCs遷移至損傷部位[44]。因此，SCI后炎性細(xì)胞可促進(jìn)趨化蛋白的表達(dá)，引導(dǎo)NSCs遷移。

2.3脊髓ENSCs的分化 損傷激活的脊髓NSCs定向遷移到損傷部位是利用ENSCs進(jìn)行SCI再生修復(fù)的第一步。遷移的NSCs定向神經(jīng)元分化是第二個(gè)需要解決的問題。神經(jīng)元分化機(jī)制近年來也得到了廣泛的研究。早期研究發(fā)現(xiàn)SCI微環(huán)境中的Nogo-A通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路促進(jìn)NSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，而這可能是NSCs神經(jīng)元分化所不能利用的[45]。此外，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路參與NSCs神經(jīng)元分化的調(diào)控也已被證實(shí)。ERK1/2信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子促進(jìn)NSCs增殖，抑制神經(jīng)元分化，而mTOR信號(hào)通路參與胰島素誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化[46-47]。髓鞘相關(guān)抑制因子(MAIs)是損傷微環(huán)境中抑制軸突再生的主要成分。最近研究發(fā)現(xiàn)，阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)-ERK信號(hào)可拮抗MAIs，通過ERK介導(dǎo)的三重基序含蛋白32(TRIM32)促進(jìn)NSCs的神經(jīng)元分化[48]。移植NSCs的結(jié)果可能受到SCI模型和供體細(xì)胞起源的差異影響。既往研究報(bào)道，擠壓和挫傷均可導(dǎo)致鼠或人NSC移植后少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，而部分或完全橫切可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[49]。還有研究表明，大鼠脊髓NSCs移植對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的貢獻(xiàn)大于神經(jīng)元[50]。這一證據(jù)表明，不利微環(huán)境中的多種因素阻礙了NSC向神經(jīng)元分化，導(dǎo)致SCI部位神經(jīng)元無法替代，最終阻礙了SCI后神經(jīng)回路的重建和功能恢復(fù)。

3 促進(jìn)ENSCs修復(fù)SCI的研究現(xiàn)狀

盡管外源性細(xì)胞移植可能會(huì)促進(jìn)SCI修復(fù)，但是與移植手術(shù)相關(guān)的致癌風(fēng)險(xiǎn)、侵襲性和并發(fā)癥也應(yīng)得到重視。此外，很難完全控制移植物的“命運(yùn)”[51]。室管膜細(xì)胞已被證明是內(nèi)源性脊髓NSCs。有尾兩棲動(dòng)物等一些動(dòng)物表現(xiàn)出強(qiáng)大的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生能力，并且能夠在SCI后幾乎完全修復(fù)受損的脊髓功能[52]。海龜會(huì)自發(fā)地重新連接切斷的脊髓，在某些情況下會(huì)導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性恢復(fù)[53]。SCI治療的主要目標(biāo)是受損軸突的再生和白質(zhì)束的再髓鞘化。因此，刺激ENSCs是一種嘗試替代SCI后失去的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的合理方法。然而，為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)需克服NSCs微環(huán)境中廣泛存在的細(xì)胞和分子變化，如細(xì)胞死亡、炎癥、不同細(xì)胞群的反應(yīng)性變化及細(xì)胞外環(huán)境分子組成的改變。最近研究表明，病理?xiàng)l件下ENSCs的行為確實(shí)可以調(diào)節(jié)，以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能恢復(fù)[54]。如ERLANDSSON等[54]發(fā)現(xiàn)使用免疫缺損NOD/SCID小鼠或與環(huán)孢霉素治療周圍性血管疾病模型，可增強(qiáng)SVZ衍生細(xì)胞向缺血損傷部位的遷移，使得細(xì)胞分化轉(zhuǎn)向膠質(zhì)細(xì)胞。

可以確定幾個(gè)與治療相關(guān)的戰(zhàn)略目標(biāo)。第一，增強(qiáng)膠質(zhì)瘢痕的有益作用，減輕對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用。SCI后形成的瘢痕長(zhǎng)期以來被視為阻止軸突再生的物理屏障，大約一半的瘢痕相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞來源于室管膜細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞向瘢痕核心遷移并產(chǎn)生有助于軸突生長(zhǎng)的層粘連蛋白[55]。GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞位于瘢痕邊緣，并分泌抑制軸突生長(zhǎng)的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)、腱生蛋白和信號(hào)素3[56]。一些研究表明，切除瘢痕組織中室管膜細(xì)胞衍生的星形膠質(zhì)細(xì)胞或反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)并導(dǎo)致病變體積擴(kuò)大、神經(jīng)元死亡增加和功能結(jié)果惡化[57]，阻斷室管膜細(xì)胞后代產(chǎn)生的瘢痕組織、病變的繼發(fā)性擴(kuò)大及進(jìn)一步的軸突丟失[58]。此外，最近的研究報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕有助于軸突生長(zhǎng)，RNA測(cè)序顯示多種軸突生長(zhǎng)分子在SCI星形膠質(zhì)細(xì)胞和非星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[59]。更有趣的是，在淡水龜中，活化的室管膜細(xì)胞有助于循環(huán)細(xì)胞的產(chǎn)生，循環(huán)細(xì)胞是SCI后允許軸突再生的重建橋架支架的重要組成部分[60]。上述研究表明這些細(xì)胞產(chǎn)生的瘢痕對(duì)SCI后恢復(fù)有不利和(或)有益影響。因此，增強(qiáng)NSCs來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)能否進(jìn)一步減少二次損傷和(或)在損傷部位創(chuàng)造一個(gè)促進(jìn)生長(zhǎng)的環(huán)境是有意義的。

第二，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。脫髓鞘未修復(fù)區(qū)是SCI后的顯著特征，譜系追蹤研究顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞約占反應(yīng)性室管膜細(xì)胞子代的3%[20]。這種低比例可能是由于IL-6相關(guān)細(xì)胞因子等星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)因子和骨形成蛋白在損傷的脊髓中高表達(dá)所致。神經(jīng)素-2過表達(dá)的神經(jīng)球在移植到損傷脊髓時(shí)促進(jìn)了少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，髓鞘化增強(qiáng)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和感覺功能的有益改變。

第三，促進(jìn)神經(jīng)元分化。損傷部位的神經(jīng)元丟失是SCI后功能缺陷的主要原因。近年研究人員研發(fā)了能改善SCI微環(huán)境的多種生物材料，如復(fù)合凝膠和水凝膠等可為細(xì)胞提供支持，防止膠質(zhì)瘢痕形成，并改善細(xì)胞分化微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元分化[61-62]。FAN等[63]研究表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子膠原結(jié)合域(CBD)-西妥昔單抗功能單元(Fab)修飾的功能性膠原蛋白支架能夠在損傷微環(huán)境中持續(xù)釋放西妥昔單抗，并與NSC表面的EGFR結(jié)合，促進(jìn)其在損傷部位的滯留，減少膠質(zhì)瘢痕形成，改善運(yùn)動(dòng)功能。除了西妥昔單抗的修飾作用外，LI等[64]證明負(fù)載紫杉醇脂質(zhì)體的有序膠原支架可以實(shí)現(xiàn)紫杉醇的緩慢釋放，改善再生環(huán)境，促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化。此外，電針、火針、高壓氧等物理治療也可促進(jìn)ENSCs的增殖、遷移和分化，有利于受損神經(jīng)元再生[65]。研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能促進(jìn)內(nèi)源性室管膜細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)SCI恢復(fù)發(fā)揮關(guān)鍵作用[66]。SIEGENTHALER等[67]指出，自愿鍛煉可減輕SCI后與年齡相關(guān)的修復(fù)缺陷，并且受傷的老年大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)率與未受傷年輕大鼠相當(dāng)。

4 展望

SCI是世界性重大醫(yī)學(xué)問題，已引起廣泛的研究。然而，以下問題仍有待解決：①損傷誘導(dǎo)內(nèi)源性巢蛋白陽性細(xì)胞來源。既往研究表明，脊髓橫斷后中央管的巢蛋白陽性細(xì)胞無法遷移到損傷部位[68]。然而近幾年報(bào)道顯示，損傷誘導(dǎo)的巢蛋白陽性細(xì)胞可遷移到損傷部位，通過定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元[64,69-70]。因此，探索損傷誘導(dǎo)的巢蛋白細(xì)胞起源對(duì)于未來的靶向治療策略具有重要意義。②神經(jīng)再生微環(huán)境的必要組成部分尚不清楚。SCI后，軸突脫髓鞘和膠質(zhì)瘢痕形成通過一個(gè)復(fù)雜的、不斷變化的過程阻礙神經(jīng)再生，這個(gè)過程涉及許多信號(hào)分子和細(xì)胞類型[71]。盡管許多研究報(bào)道了相關(guān)分子的功能，但是這些分子在損傷后不同階段的具體作用尚未系統(tǒng)全面了解。③對(duì)不利微環(huán)境的調(diào)節(jié)，結(jié)合NSCs的再生機(jī)制，可促進(jìn)SCI后神經(jīng)回路的再生。中國(guó)科學(xué)家開展了膠原支架與干細(xì)胞結(jié)合的SCI修復(fù)的國(guó)際臨床研究，在SCI修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化研究中處于領(lǐng)先地位。最新研究進(jìn)展可指導(dǎo)臨床治療改進(jìn)，應(yīng)對(duì)臨床SCI研究面臨的現(xiàn)有挑戰(zhàn)。相信不久的將來，通過深入研究，可解決上述問題，人類ENSCs移植治療終將變成現(xiàn)實(shí)。