分散固相萃取高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中滅蠅胺殘留

劉 蘭，周培華，湯春甫，康紹英，周興旺，袁列江

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410017）

滅蠅胺又名環(huán)丙氨嗪，是一種高效、低毒的生態(tài)農(nóng)藥，對(duì)雙翅目昆蟲有非常強(qiáng)的選擇性。該藥具有觸殺和胃毒作用，內(nèi)吸傳導(dǎo)性強(qiáng)、持效期長(zhǎng)，但作用速度較慢。目前GB 2763—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量 規(guī)定：豆角、芹菜、黃瓜和杧果中滅蠅胺最大殘留限量值分別為0.5、4、1 mg/kg，人體每日允許攝入量為0.06 mg/kg bw（體重）。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料報(bào)道的滅蠅胺測(cè)定方法有高效液相色譜法[1-4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]。這些方法多數(shù)采用強(qiáng)陽(yáng)離子萃取柱或者是氨基固相萃取柱進(jìn)行萃取，前處理耗時(shí)較長(zhǎng)，且操作步驟多，易造成滅蠅胺的損失，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差較大。加上滅蠅胺有別于其他酸性或中性農(nóng)藥，它是一種堿性藥劑，不適宜采用多成分的農(nóng)殘檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。筆者研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采取恒定比例的流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，進(jìn)樣3～5 次以后就會(huì)有雜質(zhì)殘留在色譜柱內(nèi)，干擾檢測(cè)，而且高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定滅蠅胺時(shí)結(jié)果受基質(zhì)效應(yīng)影響較大[8]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769—2008 水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 中也注明該方法僅為定性測(cè)定，而且質(zhì)譜檢測(cè)的儀器在市縣級(jí)基層的應(yīng)用并不普遍。滅蠅胺作為一種低毒農(nóng)藥，主要用于防治蔬菜類的美洲斑潛蠅和潛葉蠅等農(nóng)業(yè)害蟲[2]，最大殘留限量值較高，高效液相色譜法完全可以滿足滅蠅胺的定性定量準(zhǔn)確測(cè)定。

分散固相萃取是一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘檢測(cè)前處理方法，相對(duì)其他前處理方法具有一定的優(yōu)勢(shì)[10-11]。分散萃取劑乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）去除脂肪酸成分的效果較好，而十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化炭黑（GCB）去除色素和維生素成分的能力較好，可以明顯改善凈化效果[12]。為了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定蔬菜中的滅蠅胺含量，筆者采用乙酸銨乙腈提取、分散固相萃取技術(shù)從改變流動(dòng)相的配比及洗脫方式等方面優(yōu)化了蔬菜中滅蠅胺的高效液相色譜檢測(cè)方法，改良后的方法更加適用于蔬菜中滅蠅胺的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑有滅蠅胺（濃度100 μg/mL，安譜公司），乙腈（色譜純，德國(guó)CNW Technologies），乙酸銨、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。主要儀器有Agilent 1260 高效液相色譜（美國(guó)安捷倫）、Auto HG-24 全自動(dòng)勻質(zhì)機(jī)（深圳市新悅科技發(fā)展有限公司）、旋渦混合器（常州潤(rùn)華電器有限公司）、CM-1000 高速震蕩器（東京理化器械株式會(huì)社）、Milli-Q超純水器（德國(guó)Millipore）、EPPENDORF 5804R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德）、GM300 樣品研磨儀（德國(guó)萊馳）。凈化材料為乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）（Agela Technologies 公司）和0.45 μm 尼龍濾膜（天津市富成達(dá)科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件優(yōu)化（1）最佳檢測(cè)波長(zhǎng)：選擇200～400 nm 波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，從掃描目標(biāo)峰頂點(diǎn)提取光譜圖，以確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。（2）洗脫方式：以乙腈∶水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，設(shè)計(jì)恒定洗脫（乙腈∶水=97 ∶3）和梯度洗脫2 種方式，考察不同洗脫方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。（3）其他色譜條件。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱：Athena NH2-RP（4.6 mm×250 mm，5 μm，德國(guó)CNW Technologies 公司）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 滅蠅胺對(duì)照品溶液1.00 mL 到10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容到刻度，搖勻，得到10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃保存；分別精密量取適量的上述儲(chǔ)備液，用乙腈配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以色譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y）、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理優(yōu)化參照文獻(xiàn)[1]和農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法NY/T 1725—2009、GB 23200.110—2018 和GB 23200.113—2018 的樣品前處理方式制定該研究的樣品前處理方法。具體步驟為：分別取經(jīng)過(guò)組織搗碎機(jī)處理的豆角、芹菜和黃瓜樣品各10 g（精確到0.01 g），加入10 mL 提取液（0.05 mol/L 乙酸銨與乙腈按體積比1 ∶4 混合制成）渦旋混勻提取10 min；加入1.0 g 無(wú)水硫酸鎂，再震蕩提取30 min，8 000 r/min離心3 min；準(zhǔn)確吸取4.0 mL 上層有機(jī)相到10 mL 離心管，加入1.0 mL 乙腈，混勻；加入適量PSA 和C18 進(jìn)行分散固相萃取，渦旋混勻凈化1 min，10 000 r/min 離心5 min；直接吸取上清液約2 mL 過(guò)0.45 μm濾膜，濾液裝于進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。試驗(yàn)分別考察了PSA 和C18 的不同添加量（PSA 添加量為50、100、150、200、250 mg；C18 添 加 量 為15、30、45、60、75 mg）對(duì)萃取效果的影響。

1.2.4 方法驗(yàn)證和比較以未檢出滅蠅胺的樣品為空白基質(zhì)，分別向空白基質(zhì)中添加低、中、高不同含量水平的滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品，再使用PSA、C18 分散固相萃取法提取，分別采用分散固相萃取高效液相色譜法和NY/T 1725—2009 標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)定優(yōu)化后方法的加標(biāo)回收率和精密度，平行測(cè)定6 次，并比較2 種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)對(duì)市場(chǎng)隨機(jī)選取的豆角、芹菜和黃瓜各12 批次樣品使用分散固相萃取高效液相色譜法進(jìn)行滅蠅胺農(nóng)藥殘留量測(cè)定。按公式（1）計(jì)算樣品中滅蠅胺的含量。

式中，W為樣品中滅蠅胺的含量（mg/kg）；C為測(cè)得樣品的濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；80%為提取液有機(jī)相含量；V1為提取液稀釋前體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

選擇200～400 nm 范圍的波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，從掃描目標(biāo)峰頂點(diǎn)提取的光譜圖（圖1）顯示，滅蠅胺在215 nm 處具有最大吸收峰，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為215 nm 對(duì)滅蠅胺進(jìn)行定性鑒別及定量分析。NY/T 1725—2009 標(biāo)準(zhǔn)方法中高效液相色譜分析的流動(dòng)相為恒定比例的乙腈水溶液（乙腈∶水=97 ∶3），從分離的效果和連續(xù)進(jìn)樣對(duì)后續(xù)檢驗(yàn)的干擾來(lái)看，這種洗脫方式不適合連續(xù)進(jìn)樣，幾次進(jìn)樣后，殘留雜質(zhì)峰會(huì)干擾后續(xù)進(jìn)樣的目標(biāo)峰，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性以及后續(xù)樣品的分析。

圖1 滅蠅胺對(duì)照品及加標(biāo)樣品溶液目標(biāo)峰最大吸收光譜圖

通過(guò)多次摸索試驗(yàn)，優(yōu)化了流動(dòng)相的流速和配比，最終確定流動(dòng)相配比及洗脫時(shí)間如表1 所示。當(dāng)流動(dòng)相以梯度洗脫方式進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以連續(xù)批量進(jìn)樣，前后連續(xù)相鄰樣品之間的分析沒(méi)有相互干擾，滅蠅胺的保留時(shí)間為9.520 min（圖2），且在滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品出峰前后沒(méi)有其他色譜峰干擾，基線平穩(wěn)，噪音較小，多次進(jìn)樣后，系統(tǒng)無(wú)污染，無(wú)雜質(zhì)峰干擾等情況發(fā)生。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖2 空白樣品（A）和滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品（B）的液相色譜圖

2.2 分散固相萃取凈化條件的確定

由圖3 可知，隨著PSA 劑量的增加，目標(biāo)物的回收率逐漸升高，而隨著C18 劑量的增加，目標(biāo)物的回收率降低，于是最終確定PSA 的添加量為200 mg、C18 的添加量為15 mg，混合后對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取，其中色素較深的芹菜提取液在加入PSA、C18后，再加入了50 mg 的GCB 作為凈化劑。采用優(yōu)化后的前處理方法處理樣品，其中黃瓜樣品提取凈化液和加標(biāo)回收液的液相色譜圖如圖4 所示。

圖3 分散固相萃取劑不同添加量的回收率

圖4 黃瓜樣品提取凈化液（A）和加標(biāo)回收液（B）的液相色譜圖

2.3 線性范圍、回歸方程、檢出限及定量限

由標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）可知，該方法的線性范圍為0.05～1.0 μg/mL，回歸方程為y=109.408 9x-0.560 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。以空白樣品出峰時(shí)信號(hào)比S/N=3計(jì)算方法的檢出限，滅蠅胺的檢出限為0.02 mg/kg；以空白樣品出峰時(shí)信號(hào)比S/N=10 計(jì)算方法的定量限，定量限為0.05 mg/kg。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 加標(biāo)回收率和精密性

由表2 可知，分散固相萃取高效液相色譜法的平均回收率為96.3%～103.0%，RSD 為0.96%～5.02%；標(biāo)準(zhǔn)方法的平均回收率為98.3%～109.7%，RSD 為0.95%～3.87%。

表2 分散固相萃取高效液相色譜法同標(biāo)準(zhǔn)方法比較3 種蔬菜中加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.5 方法比較

以10 批次樣品的檢測(cè)為例，從結(jié)果的準(zhǔn)確性、前處理的時(shí)間、色譜柱的重復(fù)進(jìn)樣需要維護(hù)沖洗的次數(shù)等方面對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法和分散固相萃取高效液相色譜法進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表3 所示。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，分散固相萃取高效液相色譜法改進(jìn)的地方主要有：（1）前處理方法由固相萃取改為分散固相萃取凈化的方法，減少了固相萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的步驟和時(shí)間；（2）高效液相色譜方法流動(dòng)相配比由恒比例改成了梯度洗脫，減少了色譜柱雜質(zhì)殘留的影響，不需要反復(fù)沖洗色譜柱，可以無(wú)限連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣；（3）定量更準(zhǔn)確，由標(biāo)準(zhǔn)方法的單點(diǎn)標(biāo)樣定量變成標(biāo)曲定量。綜合來(lái)看，改進(jìn)后的分散固相萃取高效液相色譜法在測(cè)定蔬菜樣品中滅蠅胺殘留時(shí)具有非常明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

表3 2 種方法的比較分析

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

如表4 所示，豆角中滅蠅胺的檢出率較高，存在一定的不合格批次，可能是因?yàn)樵诜N植過(guò)程中豆角易發(fā)生病蟲害，防治藥劑使用較廣泛所致；在芹菜和黃瓜中滅蠅胺檢出批次較少，且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不合格批次，可能是因?yàn)榍鄄撕忘S瓜種植過(guò)程中滅蠅胺使用較少。

表4 3 種蔬菜中滅蠅胺的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

該研究建立了一種高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量的蔬菜中滅蠅胺農(nóng)藥殘留量的分散固相萃取高效液相色譜測(cè)定方法。該方法的檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，結(jié)合樣品的限量值，改良后的方法完全可以滿足國(guó)內(nèi)外大、中、小城市蔬菜樣品中滅蠅胺農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。前處理方法由繁瑣耗時(shí)的固相萃取加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮改良為高效簡(jiǎn)便的分散固相萃取方法；且改變了流動(dòng)相的配比和洗脫方式，不需要反復(fù)沖洗維護(hù)色譜柱，使測(cè)定變得連續(xù)且具有可重復(fù)性；定量更加準(zhǔn)確，由標(biāo)準(zhǔn)方法的單點(diǎn)標(biāo)樣定量變成了標(biāo)曲定量。改進(jìn)后的方法具有非常明顯的實(shí)際應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，解決了食品檢測(cè)行業(yè)滅蠅胺準(zhǔn)確測(cè)定這一難題。在以后的研究中，可根據(jù)技術(shù)的進(jìn)步加強(qiáng)相關(guān)食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的更新，同時(shí)注意加強(qiáng)方法適應(yīng)范圍的擴(kuò)大。通過(guò)準(zhǔn)確檢測(cè)可以督促以滅蠅胺為防治藥劑的種植戶在蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品種植過(guò)程中更加規(guī)范地使用化學(xué)藥劑，保證蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品度過(guò)農(nóng)藥間隔期再上市，提高種植者的社會(huì)責(zé)任意識(shí)，減少滅蠅胺農(nóng)藥的濫用。