UPLC-MS/MS 檢測(cè)氟吡菌酰胺在菜豆中的殘留及消解動(dòng)態(tài)

李凱龍，姚燕霞，姜錦林，羅路云，陳武瑛，黃 洪，熊 浩，陳 昂

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；3. 長(zhǎng)江師范學(xué)院，重慶 408100）

菜豆（Phaseolus vulgarisLinn.）是一種特色小宗蔬菜，原產(chǎn)于美洲，現(xiàn)廣泛種植于熱帶至溫帶各地區(qū)，中國(guó)也有栽培。菜豆用途廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富，既是中國(guó)食品加工工業(yè)的原料，也是出口創(chuàng)匯的優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品。菜豆生長(zhǎng)季節(jié)易發(fā)生病蟲(chóng)危害，常見(jiàn)病害有炭疽病、銹病和灰霉病，而目前中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml）上農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)中，作物菜豆一欄上僅登記了苯甲·氟酰胺、苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑3 種殺菌劑，在實(shí)際生產(chǎn)中，由于病蟲(chóng)害防治需要，可能會(huì)使用其他殺菌劑。

氟吡菌酰胺（fluopyram）是一種新型的苯甲酰胺類殺菌劑，具有廣譜的殺菌活性，可用于70 多種作物病害的防治，主要用于防治由白粉病菌、灰葡萄孢菌、叢梗孢屬病菌和核盤(pán)菌等引起的病害[1]。中國(guó)食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[2]和JMPR 報(bào)告（http://www.fao.org/agriculture/crops/thematic-sitemap/theme/pests/lpe/en/）中，關(guān)于氟吡菌酰胺的殘留定義描述為氟吡菌酰胺母體，而氟吡菌酰胺在土壤和植物中以母體及代謝物2-（三氟甲基）苯甲酰胺（BZM）的殘留形式廣泛存在。國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定氟吡菌酰胺在豆類蔬菜（莢可食）中的最大殘留限量（MRLs）為1.0 mg/kg（https://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/home/zh/），歐盟限量規(guī)定3.0 mg/kg（https://food.ec.europa.eu/plants/pesti cides/eu-pesticides-database_en），而中國(guó)的臨時(shí)限量規(guī)定為1.0 mg/kg[2]。目前，氟吡菌酰胺及其代謝物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于氟吡菌酰胺在番茄[6]、石榴[7]、草莓[5]等作物上的殘留規(guī)律已有少量報(bào)道，但在菜豆中的殘留及消解動(dòng)態(tài)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者擬通過(guò)改良的QuEChERS方法提取和分散固相萃取凈化，建立菜豆中氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，并通過(guò)田間試驗(yàn)分析其消解動(dòng)態(tài)，為氟吡菌酰胺在菜豆上的安全使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用儀器包括：Aglien LC1290-MS/MS 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（ABSCIEX 4500Q，美國(guó)Aglien 公司和SCIEX 公司），CPA225D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司），Centrifuge 5424 型高速離心機(jī)（Eppendorf 艾本德公司），TDL-40B 型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），微量移液器（Eppendorf艾本德公司），T25 型高速勻漿機(jī)（德國(guó)IKA）。

試驗(yàn)樣品包括：41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳股份公司），99.4%氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Ehrensorfer 公司），98.0% 2-（三氟甲基）苯甲酰胺（BZM，西格瑪奧德里奇公司），色譜級(jí)乙腈和甲醇[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]，色譜級(jí)甲酸（美國(guó)ROE），分析級(jí)乙腈、乙酸和無(wú)水硫酸鎂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），C18 凈化劑（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.2 田間試驗(yàn)方法

在長(zhǎng)沙縣春華鎮(zhèn)（露地）按照NY/T 788—2018農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則[8]的要求進(jìn)行氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，小區(qū)面積50 m2，另設(shè)相同面積的空白對(duì)照。參照該藥劑在黃瓜上的施用量（中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng) http://www.icama.org.cn/fwb/index.jhtml），設(shè)定氟吡菌酰胺在菜豆上的使用制劑量為70.6 g/hm2（以有效成分含量計(jì)算），于菜豆長(zhǎng)至成熟個(gè)體一半大小時(shí)噴霧施藥1 次，分別于施藥后2 h 以及1、3、5、7、14、21、28 d 采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置3 次重復(fù)。在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采摘生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的菜豆（不少于1 kg）混勻后切碎用四分法取200 g 以上的樣品，并于-20℃冰箱中冷凍保存至分析檢測(cè)用。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理稱取10 g 菜豆樣品于100 mL 離心管中，加入50 mL 乙腈，渦旋2 min（2 500 r/min），加入5 g NaCl，搖勻并渦旋1 min（2 500 r/min）后離心5 min（4 000 r/min）。取1.5 mL 上清液到裝有40 mg C18 的2 mL 微量離心管中，離心4 min（12 000 r/min），過(guò)0.2 μm 濾膜，待LC-MS/MS 檢測(cè)。

1.3.2 儀器條件（1）液相條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×100 mm，1.8 μm）； 柱 溫25℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；流動(dòng)相為乙腈/0.1%甲酸水（V/V）溶液，梯度洗脫如表1 所示。（2）質(zhì)譜條件：離子源類型ESI+；離子源溫度500℃；離子噴霧電壓5 500 V；氣簾氣壓力40 psi；噴霧氣壓力45 psi；輔助加熱氣壓力45 psi；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 氟吡菌酰胺和BZM 的質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g、BZM 標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g 分別置于10.0 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，分別配制成1 000.0 mg/L 濃度的標(biāo)樣儲(chǔ)備液，密封貯存在0～4℃的環(huán)境中，根據(jù)試驗(yàn)要求稀釋使用。準(zhǔn)確量取氟吡菌酰胺和BZM 母液用乙腈逐級(jí)稀釋成0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001 和0.000 5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。菜豆空白樣品經(jīng)過(guò)前處理得出基質(zhì)空白溶液，分別配制氟吡菌酰胺和BZM 菜豆基質(zhì)系列0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.0005 mg/L 濃度的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 添加回收試驗(yàn)稱取空白菜豆樣本，添加氟吡菌酰胺及代謝物BZM 標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成0.005、0.1和1.0 mg/kg 這3 個(gè)添加水平，每一水平設(shè)5 次重復(fù)，同時(shí)設(shè)不加藥的空白對(duì)照。采用實(shí)際添加可達(dá)到定量檢測(cè)的最小濃度水平為定量限（LOQ），基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，計(jì)算添加平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理氟吡菌酰胺在菜豆中的殘留量變化，采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程表示：

式中，CT為施藥后T時(shí)刻菜豆中氟吡菌酰胺的殘留量（mg/kg），C0為施藥后氟吡菌酰胺在菜豆中的動(dòng)力學(xué)方程擬合原始沉積量（mg/kg），k為菜豆中氟吡菌酰胺的消解系數(shù)，t為施藥后時(shí)間（d）。通過(guò)公式（1）計(jì)算得到消解系數(shù)k，通過(guò)公式（2）計(jì)算得到氟吡菌酰胺在菜豆中的消解半衰期T1/2（d）。

根據(jù)公式（3）計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：當(dāng)-20%＜ME ＜20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)-50%＜ME ≤-20%或20%≤ME ＜50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)ME ≤-50%或≥50% 為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[9]。

式中，km和ks分別為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度

以標(biāo)樣溶液濃度為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，氟吡菌酰胺和BZM 在溶劑和基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)如表3 所示。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍（0.000 5～0.2 mg/L）內(nèi)，氟吡菌酰胺和BZM 在基質(zhì)中呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992 0～0.999 9。這表明研究建立的殘留分析方法能滿足農(nóng)藥殘留分析所要求的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，但作物中的一些提取物可能會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)而干擾分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與精密度，因此在殘留分析中應(yīng)考慮不同作物所帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)[10-11]。由表3 可知，氟吡菌酰胺和BZM 的基質(zhì)效應(yīng)分別為6.6%和-6.0%，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)。

表3 氟吡菌酰胺和BZM 的線性方程

檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度分別以方法的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。由表4 可知，氟吡菌酰胺在菜豆上的添加回收率為91.5%～98.7%，RSD 為2.3%～4.2%；BZM 在菜豆上的添加回收率為90.5%～96.7%，RSD 為3.3%～10.1%。氟吡菌酰胺和BZM 的方法檢出限（LOD）均為0.000 5 mg/L，而最低檢測(cè)濃度（LOQ）均為0.005 mg/kg。在試驗(yàn)設(shè)置的色譜條件下，氟吡菌酰胺和BZM 的色譜峰能較好地與基線分離，且峰形完整，可以滿足農(nóng)殘分析的要求。

表4 氟吡菌酰胺和BZM 在菜豆樣品中的回收率和檢出限（n=5）

2.2 氟吡菌酰胺在菜豆中的消解動(dòng)態(tài)

由圖1A 可知，使用41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑對(duì)菜豆噴霧施藥，菜豆中氟吡菌酰胺的殘留量隨著時(shí)間的推移而逐漸降低，氟吡菌酰胺在菜豆上的原始沉積量為0.248 mg/kg；其消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：CT= 0.258 1e-0.236t，R2=0.965 3，半 衰 期 為2.9 d，施藥后28 d 消解率分別達(dá)99.8%。由圖1B 可知，氟吡菌酰胺代謝物BZM 在菜豆上的殘留量不到母體氟吡菌酰胺的10%且均小于0.005 mg/kg，因此未計(jì)算BZM 在菜豆中的半衰期；從其消解動(dòng)態(tài)來(lái)看，代謝物BZM 在菜豆上的殘留表現(xiàn)為積累和消解2 個(gè)階段，即其含量隨施藥后時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律，在施藥后第10 天達(dá)到最大殘留水平，而后逐漸消解，到施藥后28 d 菜豆上已檢測(cè)不出BZM。

圖1 氟吡菌酰胺（A）和BZM（B）在菜豆中的殘留消解動(dòng)態(tài)

3 討論與結(jié)論

該研究通過(guò)改良的QuEChERS 方法提取和分散固相萃取凈化，建立了菜豆中氟吡菌酰胺及其代謝物BZM 殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單快速、對(duì)環(huán)境友好，準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的相關(guān)要求。氟吡菌酰胺在菜豆中的半衰期結(jié)果（2.9 d）與芒果（4.3～5.4 d）[12]中的半衰期相近，快于西瓜（6.5～6.6 d）[12]、番茄（6.9～7.9 d）[6]、甜椒（7.3 d）[13]、草莓（7.2～8.2 d）[5]和石榴果實(shí)（7.3～9.1 d）[7]中的半衰期。這表明氟吡菌酰胺在菜豆中降解速度快、殘留低，屬于容易降解的農(nóng)藥，為氟吡菌酰胺在菜豆上的安全使用提供了參考數(shù)據(jù)。目前，我國(guó)尚未對(duì)氟吡菌酰胺在菜豆上進(jìn)行登記，氟吡菌酰胺在菜豆上的最大殘留限量也僅是臨時(shí)最大殘留限量，建議加強(qiáng)菜豆農(nóng)藥登記和MRL 的制定工作，保障群眾食品質(zhì)量安全。