腦立清制劑中樟腦的檢查

尹雪，焦陽(yáng)，梅桂雪，徐興燕，譚樂(lè)俊，林永強(qiáng)

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

腦立清系列制劑包括丸劑、膠囊劑和片劑3個(gè)制劑規(guī)格，處方組成一致，僅在制劑工藝上有所區(qū)別，處方由磁石、赭石、珍珠母和冰片等十味藥組成，具有平肝潛陽(yáng)，醒腦安神的功效[1]。處方中冰片具有開(kāi)竅醒腦、清熱止痛之功效。冰片又稱合成龍腦，主要是由樟腦、松節(jié)油等經(jīng)化學(xué)方法合成，冰片在合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生或殘留一定量的樟腦,另外，由于冰片的不穩(wěn)定性，在不得當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下，也會(huì)部分轉(zhuǎn)化為樟腦[3-9]。內(nèi)服樟腦會(huì)對(duì)人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用，且有實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)時(shí)間攝入樟腦，其在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝物蓄積也會(huì)產(chǎn)生一系列毒副作用[10]。因樟腦外觀和氣味與冰片相近，現(xiàn)在更有甚者人為的摻雜樟腦,給制劑帶來(lái)安全性風(fēng)險(xiǎn)。

樟腦的檢查對(duì)冰片藥材具有重要的意義，已作為檢查指標(biāo)收入《中國(guó)藥典》2020年版冰片藥材的檢查項(xiàng)下[1]。但是含冰片的制劑中尚未規(guī)定樟腦限量的檢查。本課題組以樟腦為指標(biāo)成分，對(duì)腦立清制劑中的冰片投料情況進(jìn)行了研究。建立了腦立清丸(膠囊、片)中樟腦的氣相色譜(GC)檢查法，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確認(rèn)。

1 儀器與材料

儀器：Sartorius CP225D電子天平；Agilent 7890氣相色譜儀；島津GCMS-TQ8050 NX氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

試劑：乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、乙醇均為色譜純。

對(duì)照品：樟腦(北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)：C0007316，純度：99.9%)。

樣品：腦立清系列制劑為2020年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，涉及15家生產(chǎn)企業(yè)、88個(gè)生產(chǎn)批次(包括丸劑52批，膠囊劑34批，片劑2批)。

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件 以Agilent HP INNOWAX(柱長(zhǎng)：30 m，內(nèi)徑：0.32 mm，膜厚：0.25 μm)為色譜柱；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；柱溫為140 ℃；檢測(cè)器溫度為250 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取樟腦對(duì)照品15.18 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，即得樟腦對(duì)照品溶液(濃度為0.303 3 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 腦立清丸(膠囊、片)中均以冰片原粉入藥，處方中冰片所占比例為3.125%，根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版(一部)冰片藥材項(xiàng)下樟腦檢查項(xiàng)的取樣量計(jì)算，確定腦立清丸(膠囊、片)取樣量4.8 g，最終確定供試品溶液制備方法：取腦立清丸(膠囊、片)，研細(xì)，取4.8 g(相當(dāng)于冰片0.15 g)，置錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯10 mL ，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除冰片以外的其他藥味，照處方的組成和比例制成不加冰片的陰性對(duì)照樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得不含樟腦及冰片的腦立清陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 取腦立清陰性對(duì)照樣品4.65 g和含2%樟腦的冰片0.15 g作為腦立清陽(yáng)性對(duì)照，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得含樟腦的腦立清陽(yáng)性對(duì)照溶液。

分別取上述對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照未檢出樟腦，陽(yáng)性對(duì)照檢出樟腦，說(shuō)明腦立清制劑中其他藥味對(duì)樟腦測(cè)定無(wú)干擾，該方法專屬性良好。氣相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 線性關(guān)系考察 稱取樟腦對(duì)照品207.30 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樟腦貯備溶液(C濃度=4.141 9 mg·mL-1)。分別精密量取不同體積樟腦貯備溶液配置成濃度為0.010 4、0.051 8、0.103 0、0.517 7、1.035 5、2.071 0、4.141 9 mg·mL-1的樟腦系列對(duì)照品溶液，精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測(cè)定。以樟腦峰面積值為縱坐標(biāo)，以樟腦濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果可見(jiàn)，樟腦濃度在0.010 4～4.141 9 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，回歸方程Y=875.485 762X-4.385 286,r=0.999 98。

2.4 精密度試驗(yàn) 吸取濃度為0.303 3 mg·mL-1的樟腦對(duì)照品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定。記錄峰面積分別為244.6、242.5、243.1、244.3、242.4、241.1，均值為243，RSD為0.54%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取含樟腦的腦立清陽(yáng)性樣品(編號(hào)：N03)，照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份。精密吸取上述供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算含量分別為1.78%、1.79%、1.78%、1.80%、1.79%、1.82%，均值為1.79%，RSD為0.73%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 供試品溶液的制備：取已測(cè)知含量的含樟腦的腦立清陽(yáng)性樣品(編號(hào)：N03)約4.8 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入樟腦對(duì)照品3 mg，照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取上述供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定方法的回收率良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取重復(fù)性考察項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0、3、6、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定。記錄峰面積分別為262.1、260.0、262.8、267.3、271.4、272.4，均值為266，RSD為1.94%。結(jié)果表明，樟腦在 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可以滿足檢測(cè)需要。

2.8 檢測(cè)限和定量限 分別配制一個(gè)較低濃度的樟腦對(duì)照品溶液，注入氣相色譜儀，觀察其信噪比值(S/N)，當(dāng)S/N等于3時(shí)，此時(shí)的進(jìn)樣量為檢測(cè)限(LOD)，當(dāng)S/N等于10時(shí)，此時(shí)的進(jìn)樣量為定量限(LOQ)。樟腦的LOD為0.52 ng，LOQ為1.04 ng。

2.9 陽(yáng)性樣品的氣-質(zhì)聯(lián)用驗(yàn)證 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，對(duì)88批次腦立清樣品中檢測(cè)出樟腦的陽(yáng)性樣品進(jìn)一步確證。

色譜條件：同“2.1”項(xiàng)下的色譜條件。

質(zhì)譜條件：檢測(cè)器為三重四級(jí)桿檢測(cè)器，檢測(cè)器電壓：0.1 kV；離子源為電子轟擊源(EI)，離子源溫度：200 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；質(zhì)譜檢測(cè)模式為：Q3Scan。

A.樟腦對(duì)照品；B.陽(yáng)性對(duì)照；C.陰性對(duì)照?qǐng)D1 專屬性試驗(yàn)

表1 加樣回收率考察結(jié)果

測(cè)定法：分別精密吸取氣相色譜檢查項(xiàng)下的樟腦對(duì)照品溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液、陰性對(duì)照溶液和檢出樟腦的腦立清陽(yáng)性樣品各1 μL，注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，進(jìn)行全掃描，記錄離子碎片，將其與NIST17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2.10 計(jì)算方式與限度 《中國(guó)藥典》2020年版(一部)冰片藥材項(xiàng)下規(guī)定樟腦不得過(guò)0.50%，因冰片和樟腦為揮發(fā)性成分，腦立清丸劑、膠囊劑、片劑3種制劑制備工藝不同，在制備過(guò)程中揮發(fā)性成分是否采用包和工藝、干燥溫度、時(shí)間均會(huì)對(duì)腦立清制劑中揮發(fā)性成分的含量產(chǎn)生影響，為了更合理的檢測(cè)樟腦限度，首先測(cè)定腦立清制劑中冰片(龍腦+異龍腦+樟腦)含量，以樟腦含量/冰片含量×100%進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以不得過(guò)0.50%作為限度。

2.11 GC法樣品檢測(cè)結(jié)果 采用GC法對(duì)15家生產(chǎn)企業(yè)88個(gè)生產(chǎn)批次的腦立清樣品進(jìn)行篩查，結(jié)果10家企業(yè)72個(gè)生產(chǎn)批次樟腦殘留量超出限度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 88批腦立清制劑中樟腦含量

2.12 GC-MS法驗(yàn)證結(jié)果 采用GC-MS法對(duì)檢測(cè)到樟腦的陽(yáng)性樣品進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果樟腦對(duì)照品溶液與陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性樣品中在相同保留時(shí)間出現(xiàn)了m/z為95、81、108、152等相同的離子碎片，并將其與數(shù)據(jù)庫(kù)中樟腦進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)完全匹配，陰性對(duì)照在與樟腦對(duì)照品保留時(shí)間一致的位置上未檢測(cè)到樟腦離子碎片，且與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)匹配不到樟腦離子碎片，該測(cè)定結(jié)果與氣相色譜方法結(jié)果一致。典型圖譜見(jiàn)圖2。

A.陽(yáng)性對(duì)照;B.樟腦對(duì)照品;C.陰性對(duì)照?qǐng)D2 GC-MS Q3Scan離子碎片圖

3 討論

3.1 提取因素的考察 采用單因素試驗(yàn)對(duì)提取溶劑(乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、乙醇)、提取方式(超聲處理、渦旋震蕩、靜置方式)、提取時(shí)間(5、10、15、30 min)、提取溶劑用量(5、10、20 mL)進(jìn)行考察，最終確定精密加入乙酸乙酯10 mL，超聲提取10 min為最佳提取方案。

3.2 定量方法考察 分別采用內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法制備腦立清樣品溶液，注入氣相色譜儀測(cè)定，結(jié)果內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法測(cè)定樟腦含量分別為2.35%、2.32%，結(jié)果可見(jiàn)，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)得的樟腦含量無(wú)明顯差別，表明本試驗(yàn)所用儀器靈敏度高，因此選用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。

3.3 檢測(cè)結(jié)果的分析 對(duì)15家生產(chǎn)企業(yè)88個(gè)生產(chǎn)批次的腦立清樣品進(jìn)行篩查，結(jié)果10家企業(yè)72個(gè)生產(chǎn)批次樟腦殘留量超出限度，最高者可達(dá)1.78%，問(wèn)題批次占全部批次的81.8%。針對(duì)多批次制劑中存在樟腦超限的現(xiàn)象可能存在的原因進(jìn)行分析：①冰片原料質(zhì)控不嚴(yán)，冰片藥材本身樟腦超限；②原料存儲(chǔ)方式不當(dāng)，導(dǎo)致冰片中部分龍腦氧化為樟腦；③丸劑的檢出率高于膠囊劑，推測(cè)丸劑生產(chǎn)中，40 ℃干燥過(guò)程加速了龍腦氧化為樟腦的速度，各企業(yè)干燥時(shí)長(zhǎng)差別較大，2 h到9 h不等，對(duì)冰片中龍腦的穩(wěn)定性影響較大。建議企業(yè)加強(qiáng)冰片原料管控，優(yōu)化工藝；通過(guò)建立腦立清制劑中樟腦限量標(biāo)準(zhǔn)或補(bǔ)充檢驗(yàn)方法檢查項(xiàng)，對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)做有益補(bǔ)充，以保證廣大人民群眾用藥安全。