MicroRNA 在桿狀病毒侵染過程中的功能研究進(jìn)展

張小霞，孫笑顏，楊艷青，王秋云，梁振普

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是由內(nèi)源性基因編碼的一類單鏈非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），一般含18～25 個核苷酸，能夠通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[1-3]。miRNA 廣泛存在于動植物、真菌以及病毒中，在進(jìn)化上高度保守，具有組織和時序表達(dá)特異性等特點[4-6]。miRNA 的發(fā)現(xiàn)對現(xiàn)代分子生物學(xué)意義重大，它們參與生物體內(nèi)各種調(diào)控途徑，如生物的生長發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞分化與凋亡、免疫激活以及宿主與病原體互作等，且在許多試驗中得到證實[7-9]。miRNA 最初由LEE 等[10]在研究線蟲生長發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)。迄今為止，已在271 個物種中發(fā)現(xiàn)了48 000條成熟的miRNA，這些miRNA 的發(fā)現(xiàn)為復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供了新的方向[11]。

病毒進(jìn)入宿主后，不僅可以利用宿主細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)和能量完成自身生命活動[12]，還可以依靠miRNA 對宿主免疫防御機(jī)制作出反應(yīng)[13]，目前已鑒定出多種病毒來源的miRNA，包括桿狀病毒[14]。昆蟲桿狀病毒隸屬于桿狀病毒科，因其具宿主專一性，可被研制成對環(huán)境安全的病毒殺蟲劑[15]。桿狀病毒感染昆蟲宿主后改變宿主體內(nèi)miRNA 的表達(dá)譜，一方面，病毒利用miRNA 操縱宿主和自身基因的表達(dá)；另一方面，宿主利用miRNA 以抗病毒的作用方式改變病毒對宿主細(xì)胞的感染[16]。桿狀病毒-昆蟲的相互作用在農(nóng)林業(yè)、基因治療和基因工程疫苗等方面具有重要的應(yīng)用價值，而miRNA 是桿狀病毒中研究較少的調(diào)節(jié)性RNA，在害蟲防治、益蟲保護(hù)等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，綜述了桿狀病毒感染昆蟲宿主后病毒與宿主所編碼的miRNA及其在桿狀病毒-昆蟲互作中的分子功能研究進(jìn)展，以有助于理解桿狀病毒的侵染機(jī)制和無脊椎動物的先天性抗病毒免疫機(jī)制，為桿狀病毒殺蟲劑的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 miRNA的生物合成及作用機(jī)制

miRNA 的合成主要包括轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞核內(nèi)加工、輸出細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)加工4 個步驟。首先，在RNA 聚合酶Ⅱ的催化作用下，將編碼miRNA 的基因轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄本（Primary miRNA，primiRNA）[17]；然后在細(xì)胞核中，pri-miRNA在RNaseⅢ家族Drosha 酶和輔助因子DGCR8（Microprocessor complex subunit 8）/Pasha（Partner of Drosha）蛋白的共同作用下被剪切加工成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA），長度為60～70 nt[18]；緊接著被核內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白特異識別并緊密結(jié)合，在GTP 供能的作用下通過核孔復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步被Dicer 酶及其輔助因子TRBP 切割，形成18～25 個核苷酸長度的雙鏈miRNA，隨后雙鏈被解開形成成熟的miRNA，其中一條鏈與AGO2（Argonaute 2）蛋白結(jié)合形成RNA 沉默誘導(dǎo)復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）發(fā)揮作用，另一條鏈通常被降解[19-20]。研究顯示，有些miRNA 的初級轉(zhuǎn)錄本可不依賴于Drosha 酶和DGCR8/Pasha 的剪切加工直接形成miRNA 前體[21-22]，再進(jìn)一步加工為miRNA 成熟體[17]。目前，科學(xué)家已經(jīng)在許多物種中發(fā)現(xiàn)并證實了miRNA 的存在。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與生物新陳代謝、物質(zhì)循環(huán)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程和腫瘤、心腦血管疾病等病理過程以及宿主-病毒的相互作用等[8，23]。成熟miRNA的5′端第2—8位堿基被稱為“種子區(qū)”，它們在不同物種中高度保守，通常能與mRNA 的3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，抑制翻譯或降解mRNA，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[24-25]。也有研究發(fā)現(xiàn)，某些條件下miRNA 可以與基因的5′UTR、編碼序列（CDS）或啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或激活翻譯[26-27]。

2 昆蟲宿主編碼的miRNA及其功能

2.1 昆蟲編碼的miRNA

研究昆蟲miRNA 的主要障礙之一是有限的昆蟲全基因組序列，但自2000年黑腹果蠅的基因組測序完成后，昆蟲基因組測序進(jìn)入了飛速發(fā)展的階段[28]。近年來，科學(xué)家利用新技術(shù)和新方法，鑒定了不同昆蟲編碼的miRNA，并分析了miRNA 在不同病毒感染下的表達(dá)水平，為研究miRNA 在昆蟲發(fā)育以及昆蟲-病毒互作中的功能機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)[29-30]。經(jīng)鑒定，感染藍(lán)舌病病毒的白紋伊蚊細(xì)胞與正常細(xì)胞具有140 個差異表達(dá)的miRNA[31]；在感染家蠶質(zhì)型多角體病毒的家蠶中腸與正常家蠶中腸中鑒定出406 個miRNA，其中58 個miRNA 表達(dá)具有顯著差異，說明病毒感染之后確實改變了宿主miRNA 的表達(dá)譜，揭示miRNA 在病毒感染中具有重要作用[32]。然而，桿狀病毒感染昆蟲宿主后宿主編碼的miRNA 相關(guān)研究較少[33]。據(jù)報道，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感 染Sf9 細(xì) 胞 后，miR-184 和let-7 表達(dá)量降低[34]；甜菜夜蛾核型多角體 病 毒（Spodoptera exiguanucleopolyhedrovirus，SeMNPV）感染甜菜夜蛾后，miR-2763 表達(dá)量顯著上調(diào)，且該miRNA 在不同物種中具有高度保守性[35]。通過Solexa 測序技術(shù)在棉鈴蟲核型多角體病毒（Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HaSNPV）感染的棉鈴蟲脂肪體組織中鑒定出127 個差異表達(dá)顯著的宿主miRNA，其中63 個上調(diào)、64 個下調(diào)，明顯改變了宿主miRNA 的表達(dá)譜，這為研究病毒侵染機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為桿狀病毒殺蟲劑的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)參考[36]。而對家蠶的研究是用感染和未感染家蠶核型多 角 體 病 毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的家蠶幼蟲樣品構(gòu)建了2 個小RNA 文庫，鑒定出373 個已知家蠶miRNA 和73 個新的家蠶miRNA，并證實了miRNA 的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究miRNA的功能奠定基礎(chǔ)[37]。

2.2 昆蟲miRNA的功能

研究認(rèn)為，miRNA 是參與宿主-病原體相互作用的重要角色。越來越多的研究（表1）利用深度測序技術(shù)檢測了病原體入侵宿主后宿主miRNA 的變化[38]，如擾亂miRNA 的合成途徑，抑制特定miRNA的表達(dá)等[39]。病毒感染宿主后，某些miRNA 可激發(fā)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)干擾病毒感染，而某些則被病毒利用促進(jìn)自身復(fù)制和傳播[40]。對已鑒定的家蠶miRNA 進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，一些家蠶miRNA 只在特定的發(fā)育階段表達(dá)，如bmo-miR-277 僅在蛾中表達(dá)，bmo-miR-289 僅在蛹中弱表達(dá)，而另外一些miRNA（如bmo-miR-1）在家蠶的幼蟲、蛹、蛾階段均有較強(qiáng)的表達(dá)，這顯示了特定的miRNA 可在昆蟲不同發(fā)育階段表達(dá)，提示miRNA 可能在昆蟲發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控功能[41]。BmNPV 感染家蠶后，通過抑制bmo-miR-8 的表達(dá)可顯著增加BmNPV 在脂肪體中的傳染性[42]。另有文獻(xiàn)報道，桿狀病毒感染草地貪夜蛾細(xì)胞時會引起宿主miRNA 的差異表達(dá)，導(dǎo)致miRNA 多樣化，這顯示了昆蟲-病原體相互作用的復(fù)雜性[43]。AcMNPV 感染斜紋夜蛾幼蟲時，miRNA bantam 表達(dá)水平升高，當(dāng)過表達(dá)bantam 時，一些對病毒重要基因的表達(dá)量減少，而抑制bantam 活性會導(dǎo)致Sf9 細(xì)胞存活率下降并且斜紋夜蛾幼蟲生長異常，這表明宿主在被AcMNPV 感染時會通過產(chǎn)生miRNA來抑制病毒擴(kuò)散，達(dá)到抗病毒效應(yīng)[44]。

表1 桿狀病毒感染改變的宿主miRNA及作用靶基因Tab.1 Baculovirus infection-altered host miRNAs and their tested targets

miRNA 在桿狀病毒-昆蟲互作中的研究結(jié)果對利用桿狀病毒防治害蟲、進(jìn)行基因治療和疫苗研發(fā)等具有重要意義。桿狀病毒感染宿主可操縱宿主的攀爬行為，誘導(dǎo)宿主爬到植物頂端死亡，以此促進(jìn)病毒的傳播，這一過程被稱為樹頂病[50]。據(jù)報道，保 幼 激 素（Juvenile hormone，JH）和 蛻 皮 激 素（20-hydroxyecdysone，20E）是HaSNPV 誘導(dǎo)棉鈴蟲上爬行為的關(guān)鍵成分，并且JH 和20E的下游關(guān)鍵基因BrZ2的敲除會促進(jìn)HaSNPV 誘導(dǎo)的棉鈴蟲上爬行為；研究者還發(fā)現(xiàn)，miR-8和miR-429可直接調(diào)節(jié)BrZ2的表達(dá)，參與20E 和JH 信號通路的調(diào)節(jié)，并且過表達(dá)miR-8 和miR-429 會促進(jìn)HaSNPV 的復(fù)制，提高染毒棉鈴蟲的死亡高度[36]。小菜蛾miR-8通過上調(diào)絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin27的轉(zhuǎn)錄水平阻斷昆蟲黑化反應(yīng)Toll 通路的激活和酚氧化酶原的激活，從而使機(jī)體的體液免疫遭到破壞，表明miR-8在昆蟲系統(tǒng)免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[51]。過表達(dá)bmo-miR-2819 可顯著降低BmNPV ie-1 蛋白的豐度，過表達(dá)bmo-miR-217 顯著抑制BmNPVlef-1基因的表達(dá)，影響B(tài)mNPV 的復(fù)制，這表明宿主miRNA可通過調(diào)控病毒基因的表達(dá)影響病毒感染[47-48]。JAYACHANDRAN 等[46]研 究 發(fā) 現(xiàn)，AcMNPV 感 染 棉鈴蟲后miR-14 顯著下調(diào)，miR-14 正調(diào)控棉鈴蟲的蛻皮激素受體基因（H.armigeraecdysone receptor，Ha-EcR），蛻皮激素受體是昆蟲發(fā)育過程中實現(xiàn)蛻皮的關(guān)鍵因素，表明桿狀病毒可通過利用miRNA 改變宿主生理形態(tài)實現(xiàn)自身增殖最優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，Se301 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-2763 的模擬物，會抑制SeMNPV 復(fù)制和多角體產(chǎn)生，說明miR-2763能夠響應(yīng)SeMNPV 感染[35]。綜合以上分析說明，miRNA 在病毒入侵宿主及在宿主體內(nèi)增殖時具有重要的調(diào)節(jié)作用，miRNA 的調(diào)節(jié)作用有助于進(jìn)一步了解昆蟲宿主的先天性分子免疫機(jī)制。

3 桿狀病毒編碼的miRNA及其功能

3.1 桿狀病毒編碼的miRNA

迄今為止，已有95種昆蟲桿狀病毒完成了全基因組序列測定（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=10442）。自從2008 年報道昆蟲病毒中第一個miRNA HvAv-miR-1 以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400 多個病毒來源的miRNA，主要包括皰疹病毒、腺病毒、多瘤病毒、腸囊病毒和桿狀病毒[11]。與皰疹病毒編碼的200多個miRNA的研究情況相比，桿狀病毒編碼的miRNA研究較少，目前僅集中在斜紋夜 蛾 核 多 角 體 病 毒（Spodoptera lituranucleopolyhedrovirus， SpltNPV）[52]、 BmNPV[53]、AcMNPV[54]和黎豆夜蛾核型多角體病毒（Anticarsia gemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus，AgMNPV）[55]等少數(shù)病毒中（表2）。AcMNPV 和BmNPV 是基因組學(xué)和發(fā)病機(jī)制上研究最多的2 種桿狀病毒[56]。BmNPV 可嚴(yán)重威脅家蠶養(yǎng)殖業(yè)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使用VMir軟件對BmNPV 基因組進(jìn)行掃描，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）鑒定出5個可能由BmNPV基因組編碼的miRNA 前體序列，根據(jù)前體分子發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析和RT-PCR 驗證，最后確定6 個成熟體序列，同時利用高通量測序技術(shù)和RT-PCR 技術(shù)確定了7個miRNA 成熟體序列，并對某些miRNA 進(jìn)行了功能預(yù)測，揭示了病毒miRNA 復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為家蠶的病毒防治提供了新思路和新方法[57-58]。利用Solexa 技術(shù)對AcMNPV 感染的Sf9 細(xì)胞進(jìn)行小RNA測序，通過生物信息學(xué)分析和試驗驗證，鑒定出5個來 自AcMNPV 的miRNA[54]。KHARBANDA 等[52]利用生物信息學(xué)預(yù)測出48 個SpltNPV 編碼的miRNA，其中10 個miRNA 利用Northern blot 雜交和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)在SpltNPV 感染的Sf21細(xì)胞中得到證實，并且大多數(shù)miRNA 在感染72 h后達(dá)到較高表達(dá)水平。此外，研究人員基于種子區(qū)序列的保守性，用生物信息學(xué)方法篩選出了AgMNPV編碼的miRNA AgMNPV-miR-4[55]。

表2 桿狀病毒編碼的miRNA及作用靶標(biāo)Tab.2 Baculovirus-encoded miRNAs and experimentally verified targets

3.2 桿狀病毒miRNA的功能

在病毒-宿主共同進(jìn)化的過程中，病毒編碼的miRNA 為病毒提供了生存優(yōu)勢[67]。這些miRNA 不僅控制了病毒的生命周期，還操縱了宿主免疫基因的表達(dá)，從而使其能在宿主細(xì)胞中成功繁殖[68-69]。盡管目前對桿狀病毒產(chǎn)生的miRNA 功能的研究有限，但是它們具有與哺乳動物miRNA 類似的功能[70]。桿狀病毒感染宿主后，可以某種特定的方式利用miRNA 進(jìn)行增殖，參與調(diào)節(jié)宿主與病毒的基因網(wǎng)絡(luò)，延長其生存時間，最終使宿主細(xì)胞裂解[71]。

利用miRanda 軟件預(yù)測，AcMNPV-miR-1 可作用于病毒基因ac11、ac15、ac18、ac30、ac34、ac55、ac64、ac66、ac82、ac94、ac95、ac101、ac131和ac135[59]。在這些候選靶基因中，ac94得分最高，并且ac94編碼的ODV-E25 蛋白位于包埋型病毒粒子（Occlusion derived virus，ODV）和芽生型病毒粒子（Budded virus，BV）的包膜中，這對于產(chǎn)生ODV 和BV 尤為重要[59]。雙熒光素酶試驗也證實了AcMNPV-miR-1 和ac94基因之間存在相互作用[60]。ac18和ac95也通過相同的試驗得到了證實[61]?？傊?，過表達(dá)AcMNPV-miR-1可降低BV的傳染性，減少病毒DNA 的復(fù)制，加速ODV 的形成。JIAO 等[62]研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV-miR-3可下調(diào)ac101的表達(dá)，過量的AcMNPV-miR-3 可減少BV 的產(chǎn)生，加速ODV的形成，這些結(jié)果表明AcMNPV-miR-3 可能在BV和ODV 的產(chǎn)生中起調(diào)節(jié)作用。病毒產(chǎn)生的miRNA也可通過降低病毒蛋白的表達(dá)降低其抗原性，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)[72]。起初，人們認(rèn)為病毒產(chǎn)生的miRNA 是為了對抗宿主基因，然而，最近的研究結(jié)果表明，病毒miRNA 介導(dǎo)的病毒基因調(diào)控對于病毒維持宿主內(nèi)持續(xù)感染至關(guān)重要[54]。在病毒感染早期階段，BmNPV-miR-3 通過負(fù)調(diào)控病毒DNA 結(jié)合蛋白（P6.9）和一些參與病毒組裝的晚期基因的表達(dá)，使病毒保持最低病毒載量，自主控制BmNPV 的增殖，避免過度復(fù)制導(dǎo)致宿主過早死亡，并且在感染初期階段，阻礙晚期基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，表明病毒可通過編碼miRNA 逃避宿主早期免疫識別，且miRNA 在病毒持續(xù)感染宿主中起著至關(guān)重要的作用[64，73]。

在桿狀病毒感染過程中，病毒編碼的miRNA 可調(diào)控宿主基因，從而參與免疫反應(yīng)[74]。病毒逃逸免疫反應(yīng)的策略之一是抑制宿主miRNA 的數(shù)量，因為在某些情況下，宿主miRNA 可發(fā)揮抗病毒功能[75]。BmNPV-miR-1 就是通過這種策略來調(diào)節(jié)宿主防御，BmNPV-miR-1 下調(diào)宿主GTP 結(jié)合核蛋白Ran的表達(dá)，而Ran 是exportin-5 介導(dǎo)的核質(zhì)運輸機(jī)制的重要組成部分，主要參與miRNA 從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運輸，由于BmNPV-miR-1 抑制了Ran，導(dǎo)致宿主miRNA 種群減少，從而增加感染幼蟲中BmNPV的數(shù)量[42]。WANG 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV-miR-4可顯著下調(diào)參與細(xì)胞凋亡的宿主基因，而對病毒基因卻沒有明顯的抑制作用，這表明AcMNPV 編碼的miRNA 可通過調(diào)節(jié)宿主基因來建立感染，從而在宿主-病毒相互作用中發(fā)揮功能。miRNA 不僅可以靶向病毒和宿主的基因，還可以與宿主miRNA 相互作用。CAO 等[65]研究發(fā)現(xiàn)，BmNPV-miR-415 可與宿主miR-5738 互作，這類miRNA 并未直接作用于宿主免疫相關(guān)基因，從而避免在病毒感染早期階段刺激宿主免疫系統(tǒng)，確保宿主環(huán)境穩(wěn)定，從而更好地感染宿主細(xì)胞，最終導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)崩潰。

4 小結(jié)

miRNA 對于研究生命發(fā)育和疾病機(jī)制具有重要意義。自發(fā)現(xiàn)以來，其功能研究一直是人們關(guān)注的焦點，miRNA 在疾病、病毒免疫以及害蟲防治、益蟲保護(hù)等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，與基因編碼蛋白質(zhì)一樣，miRNA 也能響應(yīng)生物脅迫，該領(lǐng)域的研究結(jié)果為生物學(xué)研究提供了新方向和新思路[76]。在病毒學(xué)中，桿狀病毒具有特殊地位，它們在不同領(lǐng)域中有不同的應(yīng)用，作為真核表達(dá)載體系統(tǒng)，可廣泛表達(dá)外源蛋白，用于表達(dá)免疫活性分子、藥物研發(fā)以及疫苗生產(chǎn)等方面[77]；作為基因轉(zhuǎn)移載體用于基因治療[78]；作為生物殺蟲劑用于控制農(nóng)林害蟲、保護(hù)環(huán)境等[79]。雖然在桿狀病毒基因組中預(yù)測到大量可編碼miRNA 的基因，但到目前為止，只有很少的桿 狀 病 毒，即BmNPV、AcMNPV、SpltNPV 和AgMNPV 被報道編碼miRNA[38，80]。與發(fā)現(xiàn)的宿主miRNA 相比，桿狀病毒miRNA 較少，對其功能機(jī)制的研究也不深入，但隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，相信未來的情況將發(fā)生變化。桿狀病毒通過編碼miRNA 直接作用于病毒或宿主基因，或結(jié)合宿主miRNA，或控制自身增殖等影響宿主生理過程，從而逃避宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)；昆蟲宿主通過編碼miRNA 調(diào)控自身或病毒基因，激活抵抗病毒感染的蛋白質(zhì)，從而激活天然免疫系統(tǒng)，抑制病毒增殖[81]。

綜上，從miRNA 角度闡述了桿狀病毒-昆蟲宿主之間的相互作用和協(xié)同進(jìn)化，有助于理解基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和無脊椎動物的先天性免疫機(jī)制，為利用RNA 干擾（RNAi）技術(shù)進(jìn)行害蟲防治和益蟲保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持，并為桿狀病毒殺蟲劑的研發(fā)和應(yīng)用提供理論支持。