綠色木霉Tv－1511及其生物有機肥對鹽堿地小麥、玉米生長及其產(chǎn)量的影響

霍雪雪，張豪，黃艷華，李哲，鄭澤慧，郝永任，王慶玲，郭凱，2

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所，山東 濟南 250014；2. 山東師范大學(xué)環(huán)境與生態(tài)研究院，山東 濟南 250358)

近年來，全球土壤的鹽漬化程度不斷加劇，如何有效利用鹽堿地已經(jīng)成為全世界的熱點問題[1]。鹽堿地的共性是土壤有機質(zhì)和營養(yǎng)成分低、理化性狀不良、微生物活動受限、無法維持植物健康生長，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。施用生物有機肥可以提高土壤肥力，改善土壤結(jié)構(gòu)，降低毛細(xì)水的運移速度，減少水分的無效蒸發(fā)，有明顯的抑制返鹽效果。施用生物有機肥還能增加土壤有效鈣的含量，同時微生物分解有機質(zhì)產(chǎn)生的有機酸也能活化土壤吸附的鈣，增強土壤中吸附鈉的置換，導(dǎo)致脫鹽脫堿。因此，開發(fā)一種鹽堿地區(qū)適宜的生物有機肥，是加速鹽堿地土壤改良的有效途徑。生物有機肥發(fā)揮作用的核心是具有特定功能的微生物。針對鹽堿地的特點，篩選能夠耐受鹽堿環(huán)境的功能微生物，是決定生物有機肥有效性的關(guān)鍵。

木霉菌(Trichodermaspp.)是廣泛分布于自然界中的有益真菌，是工業(yè)上重要的酶制劑生產(chǎn)菌株，是土壤環(huán)境中有毒物質(zhì)的降解菌株，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的植病生防菌株，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域及環(huán)境保護領(lǐng)域均有著廣泛應(yīng)用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉可以通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性[4]、降低鹽脅迫導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化[5]、增強植物的光合作用[6]等方式來提高植物耐鹽性。此外，木霉還可以提高植物在鹽堿環(huán)境下的抗病能力[7]。綠色木霉是兼具促生和生防功能的有益真菌，可定殖于植物根際形成共生體，一定程度上增加植物根系養(yǎng)分吸收利用率、促進植物生長、提高產(chǎn)量及誘導(dǎo)植物增強抗逆性等[8]。但目前篩選獲得的耐鹽堿綠色木霉菌株種類有限，進一步篩選出具有抗逆、促生和增產(chǎn)等多方面功能的綠色木霉具有重要意義。

因此，本研究對本單位前期篩選獲得的一株綠色木霉(Trichoderma viride)Tv－1511 進行耐鹽性分析，探究其提高植物耐鹽性的機制，同時結(jié)合Tv－1511 生物有機肥對濱海鹽堿地作物產(chǎn)量的影響，評價其應(yīng)用于提高植物耐鹽和鹽土改良的可行性，以期為木霉類生物有機肥的推廣應(yīng)用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)，為濱海鹽堿地開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株:綠色木霉菌(Trichoderma viride)Tv－1511，齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所保存。

供試作物:小麥品種濟麥22，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育；玉米品種華農(nóng)138 號，購自北京華農(nóng)偉業(yè)種子科技有限公司。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDA)液體培養(yǎng)基。

田間示范試驗地:土壤有機質(zhì)含量為0.61%～1.01%，且高鉀低氮低磷；pH 值偏堿性，高于8.0；鹽分含量0.3%～0.6%，屬于中重度鹽漬化土。

供試木霉生物有機肥:由金星(日照)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，按生物有機肥[以尾菜和玉米秸稈為原料，經(jīng)過高溫發(fā)酵生產(chǎn)而得，徹底腐熟后含水量≤30%、有機質(zhì)≥45%、全氮4%、全磷(P2O5)4%、全鉀(K2O)2%、硫酸鋅(ZnSO4)0.05%、游離氨基酸(amino acid)1%]干重的5%添加木霉固體發(fā)酵物制成，木霉孢子數(shù)量為2×108cfu/g。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠色木霉Tv－1511 耐鹽性評價試驗 用打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm 的綠色木霉Tv－1511 菌塊，分別接種于NaCl 濃度為0、100、200、300 mmol/L 和400 mmol/L 的PDA 平板上，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測定Tv－1511 生長圈的半徑，掃描生長圈的形態(tài)和大小。

1.2.2 小麥水培試驗 取小麥種子進行催芽育苗，待長出3 片葉時移至水培裝置。采用正交試驗設(shè)計，分別以不同濃度(0、100、200 mmol/L)NaCl 溶液和不同濃度(0、105cfu/mL)Tv－1511 孢子液兩兩組合，共計6 個處理，分別記為CK: 對照(0 mmol/L NaCl)；Tv－1511:105cfu/mL 孢子液處理；S: 100 mmol/L NaCl 處理；S＋Tv－1511: 100 mmol/L NaCl 和105cfu/mL 孢子液處理；SS: 200 mmol/L NaCl 處理；SS ＋Tv－1511: 200 mmol/L NaCl 和105cfu/mL 孢子液處理。每處理3 盆，每盆小麥4 株，重復(fù)3 次。

分別于處理0、7、14、21 d 進行生長指標(biāo)(株高、根長、葉長、葉寬)測定；處理21 d 后進行生物量(干重、鮮重)、光合色素含量(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)、過氧化氫(H2O2)含量和抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)的測定。

1.2.3 木霉生物有機肥大田試驗 試驗在黃河三角洲農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)中進行，2018年10月至2019年6月種植小麥， 2019年6月至2019年11月種植玉米。以不施肥(CK)和常規(guī)施肥(CF)為對照，設(shè)置木霉Tv－1511 生物有機肥替代15%、30%和100%化肥處理，分別記為T1、T2 和T3。隨機區(qū)組排列，重復(fù)3 次。小區(qū)面積160 m2。所有處理按當(dāng)?shù)厥┓史绞剿桊B(yǎng)分統(tǒng)一施肥，常規(guī)管理。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標(biāo) 株高:測定莖基部到葉片自然伸展時的最高處；葉長:測定第3 片葉(從上向下)葉基到葉尖的長度，不含葉柄；葉寬:測定第3片葉(從上向下)上與主脈垂直方向上的最寬處；莖粗:用游標(biāo)卡尺測定距莖基部2 cm 處的直徑；根長:測定主根長度。

1.3.2 生物量 取植株鮮樣用蒸餾水沖洗干凈，然后用吸水紙吸干表面水分，將植株分為地上和地下兩部分，分別稱鮮重；將地上和地下部分開放入烘箱中105℃烘15 min，之后65℃烘干至恒重，稱干重。

1.3.3 光合色素含量 每株從上至下選取第3片完全展開葉進行光合色素測定。取新鮮葉片0.05 g用95%乙醇中避光萃取48 h，至葉片發(fā)白。取萃取液以95%乙醇稀釋5 倍后分別于665、649 nm 和470 nm 波長下進行比色，計算葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量[9]。

1.3.4 過氧化氫含量和抗氧化酶活性 過氧化氫含量采用過氧化氫測定試劑盒測定(A064－1，比色法)。SOD 活性采用總超氧化物歧化酶(TSOD)測試盒(A001－1，羥胺法) 檢測，POD 活性采用過氧化物酶(POD)測試盒(A084－3，比色法，南京建成科技有限公司) 檢測，CAT 活性采用過氧化氫酶(CAT)測試盒(A007－1，可見光法) 檢測。以上試劑盒均購自南京建成科技有限公司，試驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 產(chǎn)量 小麥成熟后，每小區(qū)隨機選取3 個1 m2樣方全部收獲，脫粒曬干后稱重計產(chǎn)，然后換算成含水量13%的單位面積產(chǎn)量。玉米成熟后，每小區(qū)隨機選取長勢均勻的2 壟玉米收獲，脫粒曬干后稱重計產(chǎn)，然后換算成含水量為14%的單位面積產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010 進行統(tǒng)計，采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色木霉Tv－1511 耐鹽性分析

由圖1 看出，不同濃度NaCl 處理對木霉Tv－1511 菌株生長有不同程度的影響。隨著NaCl 濃度的升高，Tv－1511 生長速率呈降低趨勢，且隨著培養(yǎng)時間延長，影響效果也呈降低趨勢。當(dāng)NaCl濃度為400 mmol/L 時，培養(yǎng)24、48、72、96 h 和120 h 的對照菌落半徑是處理菌株的2.61、2.26、2.06、1.92 倍和1.87 倍，Tv－1511 表現(xiàn)出較強的耐鹽性。

圖1 不同濃度NaCl 溶液對綠色木霉Tv－1511 菌株生長的影響

2.2 綠色木霉Tv－1511 對不同濃度鹽脅迫下小麥幼苗生長的影響

由圖2 看出，正常生長條件下(0 mmol/L NaCl)，綠色木霉Tv－1511 處理小麥各生長指標(biāo)均高于CK，呈現(xiàn)一定的生長優(yōu)勢；鹽脅迫條件下，Tv－1511 處理小麥生長優(yōu)勢更為明顯。正常生長條件下Tv－1511 處理21 d 時小麥株高、根長、葉長和莖粗是CK 的1.20、1.22、1.17 倍和1.21 倍，而在200 mmol/L NaCl 脅迫下，Tv－1511 處理21 d時小麥幼苗相應(yīng)生長指標(biāo)是未處理組的1.25、1.38、1.29 倍和1.33 倍，其中根長增加最為顯著。因此，綠色木霉Tv－1511 可以促進小麥生長，且鹽脅迫下效果更為顯著。

圖2 Tv－1511 孢子液對鹽脅迫下小麥生長的影響

分析綠色木霉Tv－1511 對鹽脅迫下小麥生物量的影響，結(jié)果(表1)表明，各鹽濃度下Tv－1511 處理小麥植株鮮重和干重均顯著高于各自未處理組(P<0.05)，且促進效果與生長指標(biāo)一致。與未用Tv－1511處理的小麥相比，Tv－1511處理小麥植株地下部鮮重和干重分別增加27.03%和28.57%，而200 mmol/L NaCl 處理后，相應(yīng)的增長量變?yōu)?9.54%和38.46%。因此，綠色木霉Tv－1511 可以促進小麥生物量積累，而且鹽脅迫條件下表現(xiàn)出更明顯的優(yōu)勢。

表1 Tv－1511 孢子液對鹽脅迫下小麥生物量的影響

2.3 綠色木霉Tv－1511 對不同濃度鹽脅迫下小麥葉片光合色素含量的影響

由圖3 看出，隨著鹽濃度的增加，Tv－1511 處理組和未處理組小麥葉片的光合色素含量均有所下降，但相同濃度NaCl 處理下，Tv－1511 處理組的光合色素含量均顯著或極顯著高于未處理組(P<0.05 或P<0.01)。其中，Tv－1511 處理組的葉綠素a 含量是未處理組的1.93 倍(100 mmol/L NaCl)和2.33 倍(200 mmol/L NaCl)；葉綠素b 含量是未處理組的1.88 倍(100 mmol/L NaCl)和2.14倍(200 mmol/L NaCl)；類胡蘿卜素含量是未處理組的1.76 倍(100 mmol/L NaCl)和2.18 倍(200 mmol/L NaCl)。因此，綠色木霉Tv－1511 可以通過增加小麥葉片的光合色素含量來促進光合作用，并且在鹽脅迫下這一效果更為明顯。

圖3 Tv－1511 孢子液對不同濃度鹽脅迫下小麥光合色素含量的影響

2.4 綠色木霉Tv－1511 對不同濃度鹽脅迫下小麥幼苗H2O2含量和抗氧化酶活性的影響

由圖4 看出，在正常生長(0 mmol/L NaCl)條件下，Tv－1511 處理組表現(xiàn)出與未處理組同等水平的H2O2含量；鹽脅迫處理后，H2O2含量均增加，且相同濃度NaCl 處理下，Tv－1511 處理的H2O2含量極顯著低于未處理組(P<0.01)。與未用Tv－1511處理的小麥幼苗相比，Tv－1511 處理組的H2O2含量分別降低23.10%(100 mmol/L NaCl)和36.48%(200 mmol/L NaCl)。

圖4 Tv－1511 孢子液對鹽脅迫下小麥H2O2含量和抗氧化酶活性的影響

正常生長條件下，Tv－1511 處理組和未處理組小麥幼苗的抗氧化酶活性無顯著性差異；鹽脅迫處理后，Tv－1511 處理組小麥的CAT、SOD 和POD 活性顯著或極顯著高于未處理組(P<0.05或P<0.01)。在正常生長條件下，Tv－1511 處理組小麥CAT、SOD 和POD 活性是未處理組的1.13、1.08倍和1.08倍；而在200 mmol/L NaCl 脅迫下，相應(yīng)的抗氧化酶活性是未處理組的1.26、1.31 倍和1.36 倍。因此，綠色木霉Tv－1511 可以通過增強抗氧化酶活性提高小麥耐鹽性。

2.5 綠色木霉Tv－1511 制備的生物有機肥對小麥、玉米生長及產(chǎn)量的影響

2.5.1 對小麥和玉米生長的影響 由圖5 看出，與不施肥CK 和常規(guī)施肥CF 相比，T1、T2 和T3處理均能促進小麥和玉米生長。其中，T1、T2、T3處理小麥、玉米(拔節(jié)期)株高分別是CK 的1.17、1.21、1.13 倍和1.41、1.64、1.29 倍，是CF 的1.07、1.10、1.03 倍和1.20、1.39、1.10 倍。相比各施肥處理，T2 處理的生長優(yōu)勢最為顯著(P<0.05)。與CF 相比，T2 處理小麥、玉米的莖粗、葉長、葉寬分別增加4. 58%、 31. 64%、 17. 88% 和21.14%、25.33%、27.52%。因此，木霉Tv－1511 生物有機肥可以促進鹽堿地小麥和玉米生長，且以生物有機肥替代30%化肥處理促生效果最為顯著。

圖5 不同施肥處理對小麥和玉米生長的影響

2.5.2 對小麥和玉米產(chǎn)量的影響 由表2 看出，與不施肥CK 相比，T1、T2、T3 處理小麥產(chǎn)量分別增加43.99%、62.90%和35.45%；與常規(guī)施肥CF相比，T1、T2、T3 處理小麥產(chǎn)量分別增加18.95%、34.57%和11.90%。

木霉Tv－1511 生物有機肥施肥處理也顯著提高玉米產(chǎn)量(表2、圖6)。與CK 相比，T1、T2和T3 處理分別增產(chǎn)61.74%、71.76%和42.00%；與CF 相比，T1、T2 和T3 處理分別增產(chǎn)31.54%、39.69%和15.48%，差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。因此，木霉Tv－1511 生物有機肥可以增加鹽堿地小麥和玉米產(chǎn)量，且以替代30%化肥的增產(chǎn)效果更為顯著。

圖6 不同處理收獲的玉米果穗

表2 不同施肥處理小麥和玉米產(chǎn)量

3 討論與結(jié)論

高鹽環(huán)境會嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，是造成植物減產(chǎn)或死亡的主要因素之一。利用植物與根際土壤微生物的共生關(guān)系，可促進植物對生物和非生物的耐受性，緩解鹽脅迫對植物生長造成的不利影響[10]。木霉菌是自然界廣泛分布的多功能有益真菌，是土壤微生物的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌可以通過調(diào)控植物根系發(fā)育[11]、改變植物激素水平[12]、改善植物營養(yǎng)狀況[13]等減輕鹽脅迫對植物的不利影響，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對鹽脅迫的耐受性。本研究中，前期篩選獲得的一株綠色木霉Tv－1511 的孢子液對小麥生長和生物量均有一定的促進作用，且鹽脅迫下效果更為顯著。此外，木霉還可以降低葉綠素的分解，增強植物在鹽脅迫下的光合作用。Oljira等[6]研究發(fā)現(xiàn)，木霉可以緩解鹽脅迫對小麥光合作用的抑制，提高小麥葉片的葉綠素含量和凈光合速率；Soliman 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，木霉提高鹽脅迫下南瓜葉片的光合色素含量，增強光合作用強度。本試驗結(jié)果顯示，綠色木霉Tv－1511 能夠顯著增加鹽脅迫條件下小麥葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，說明Tv－1511 可以緩解鹽脅迫對光合作用的抑制，提高鹽脅迫條件下小麥的光合作用強度。

鹽脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞中活性氧和自由基的大量積累，對細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷。植物的抗氧化系統(tǒng)可以清除這些自由基和活性氧，促進細(xì)胞對鹽脅迫的耐受性。趙忠娟等[15]研究發(fā)現(xiàn)，木霉可以通過增加SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶的活性，有效緩解鹽脅迫對植物的膜脂過氧化程度；Boamah 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，除酶促防御系統(tǒng)外，木霉還可以通過激活非酶促抗氧化系統(tǒng)(抗壞血酸、還原性谷胱甘肽、類黃酮、生物堿、類胡蘿卜素)來清除過多的活性氧，使植物抗氧化能力和耐鹽性顯著增加。與上述研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉Tv－1511 處理小麥幼苗鹽脅迫條件下的H2O2含量明顯低于對照，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性明顯高于對照，說明Tv－1511 能夠通過抗氧化防御途徑增強小麥的耐鹽性。本研究結(jié)果對開發(fā)和利用耐鹽高效木霉菌株具有重要的理論和生產(chǎn)意義。

木霉對植物的解鹽促生作用與植物生長基質(zhì)有密切的關(guān)系。在缺少基質(zhì)的情況下，木霉會受到土壤理化性質(zhì)的影響，很難成功定殖并大量繁殖。有機肥是改良鹽堿地的優(yōu)良材料，木霉菌能夠以有機肥為載體，快速占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位，有效發(fā)揮解鹽促生作用[16，17]。肥料主要有無機、有機、生物三大類，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，既能單獨施用，也能混合施用。田家明等[18]對比了基施不同量生物有機肥(0、3 000、6 000、9 000 kg/hm2)對鹽脅迫下花生生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)有機肥用量為6 000 kg/hm2時促生增產(chǎn)效果最佳；趙政等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與等養(yǎng)分的100%化肥相比，普通有機肥或木霉孢子液灌根配施會降低番茄產(chǎn)量，而木霉生物有機肥與化肥配施，可顯著提高番茄品質(zhì)和產(chǎn)量，長期施用還可提高土壤微生物數(shù)量、改善土壤肥力；Jiang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，生物有機肥可以顯著改善鹽堿地的微生物區(qū)系，但過多的肥料施入，特別是化肥，反而會抑制微生物的活性。因此，有必要對鹽堿地施肥種類與數(shù)量，比如生物有機肥與化肥的配比等開展研究。于亞楠等[21]對木霉生物有機肥與化肥應(yīng)用于濱海鹽土的最優(yōu)配比進行了探究，發(fā)現(xiàn)60%木霉生物有機肥與40%化肥配施為最優(yōu)；李瑞霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，減施25%化肥同時配施木霉生物有機肥，可通過調(diào)控土壤養(yǎng)分有效性、土壤微生物區(qū)系和土壤酶活性來改善鹽土的可耕種性，從而提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)；王歡[23]研究發(fā)現(xiàn)，減施30%化肥同時配施木霉生物有機肥能夠緩解土壤鹽脅迫，增加土壤有機質(zhì)和有效磷含量，改善鹽土黃瓜果實品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，與不施肥和常規(guī)施肥相比，Tv－1511 生物有機肥替代15%、30% 和100%化肥均可顯著促進玉米、小麥的生長及產(chǎn)量的增加，說明養(yǎng)分并不是影響鹽堿地植株生長發(fā)育的唯一因素，這與王福友等[24]的研究結(jié)果一致。其中，Tv－1511 生物有機肥替代30%化肥的促生增產(chǎn)效果最佳，這一比例的生物有機肥與化肥協(xié)同作用，顯著促進了小麥和玉米在鹽堿地中的生長，提高產(chǎn)量。本研究結(jié)果可為木霉類生物有機肥的推廣應(yīng)用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。