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    小反芻獸疫基因工程疫苗的研究進展

    2022-12-20 02:20:38郗珊珊賈偉娟秦瑤楚秋娟李文博何云江孟慶磊陳云嬌王學(xué)理
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:痘病毒毒株山羊

    郗珊珊,賈偉娟,秦瑤,楚秋娟,李文博,何云江,孟慶磊,陳云嬌,王學(xué)理

    (1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2. 內(nèi)蒙古良欣農(nóng)牧業(yè)開發(fā)有限公司,內(nèi)蒙古 赤峰 024000;3. 巴林左旗科技創(chuàng)新和成果轉(zhuǎn)化中心,內(nèi)蒙古 赤峰 024000 )

    小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)又稱“羊瘟”,是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一種危害嚴(yán)重的山羊、綿羊和野生小反芻獸高度接觸性傳染病。PPRV 屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus),同屬的成員還包括牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper vieus, CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus, PDV)及麻疹病毒(Measles virus,MV)等。PPRV 基因組全長15 948 nt,病毒粒子大多數(shù)呈圓形或橢圓形,直徑為130 ~ 390 nm,有囊膜包裹,主要包含N、P、M、F、H、L 六種結(jié)構(gòu)蛋白和C、V 兩種非結(jié)構(gòu)蛋白[1-3],其結(jié)構(gòu)、復(fù)制周期及各蛋白功能分別如圖1、圖2、表1 所示。

    表1 小反芻獸疫病毒編碼蛋白

    圖1 PPRV 結(jié)構(gòu)示意圖[15]

    圖2 PPRV 復(fù)制周期[16]

    根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),PPRV 只有一個血清型,可分為4 個系,Ⅰ系主要分布在西非,Ⅱ系在尼日利亞、喀麥隆北部等地大量分布,Ⅲ系主要分布在非洲東部,Ⅳ系主要在中東和西亞地區(qū)流行。1942年P(guān)PR 首次發(fā)現(xiàn)于西非的科特迪瓦,之后擴散到阿拉伯半島、中東、南亞等地,2007年傳入我國西藏阿里地區(qū),2013年后新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地陸續(xù)有該病的報道[4,5]。2015—2019年間,66 國向世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)報告了12 757 起疫情,亞洲和中東9 582 起,占75.1%;非洲3 166 起,占24.8%;歐洲(保加利亞)9 起,占0.1%。其中貝寧(480 起)、阿富汗(824 起)、伊朗(3 710 起)、科威特(761 起)和土耳其(402 起)這五個國家的PPR 疫情占比48.4%,迫切需要加強對PPR 的預(yù)防和控制[6]。PPRV 的潛伏期為2~7 d,以高熱、口腔黏膜糜爛、眼部分泌物增加、白細(xì)胞數(shù)量減少、腹瀉和呼吸困難為特征。通常在出現(xiàn)發(fā)熱癥狀后的4 ~ 6 d 內(nèi)迅速死亡,有著高發(fā)病率(可達100%)和高死亡率(可達90%)。該發(fā)病特點給PPRV 的臨床預(yù)防、診斷和治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),OIE 和糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization,F(xiàn)AO)計劃將在2030年前徹底消除PPR[7,8]。

    目前該病主要靠疫苗免疫進行預(yù)防,科研人員已研發(fā)出Nigeria 75/1、Sungri/96、Arasur/87 和Coimbatore/97 四種PPR 同源弱毒苗[9],其中以Nigeria 75/1 和Sungri/96 應(yīng)用最為廣泛,可對四種譜系的PPRV 產(chǎn)生良好的保護性免疫[10-13]。但是這種疫苗還不能達到區(qū)分疫苗毒株和野毒株感染(differentiation of infected versus vaccinated animals, DIVA)以及安全高效的效果,因此新型疫苗的研發(fā)顯得尤為重要[14]。隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展,基因工程苗研究也隨之成熟,并且有著與弱毒疫苗相似的效果,有望進行大規(guī)模應(yīng)用。

    1 重組亞單位疫苗

    F 蛋白和H 蛋白是PPRV 囊膜表面的兩種糖蛋白,均可誘發(fā)保護性免疫應(yīng)答,其中H 蛋白相較F 蛋白能產(chǎn)生更高水平的中和抗體,是宿主免疫應(yīng)答的主要靶點,因此H 蛋白是目前PPR 亞單位疫苗和重組活載體疫苗的主要免疫性抗原[24]。在研究中可將表達H 和F 蛋白的桿狀病毒用作亞單位疫苗的抗原,它們能引起強烈的中和抗體反應(yīng),卻不能對強毒株提供免疫保護,但將桿狀病毒表達的H 蛋白嵌入免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)中,就可對強毒攻擊起到較好的保護作用[25]。其中ISCOM 能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),因此該反應(yīng)可能是誘導(dǎo)針對PPRV 的保護性免疫反應(yīng)的主要因素。

    目前已有多種原核和真核表達系統(tǒng)用于制備病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP),VLP 僅由PPRV 衣殼蛋白組成,缺乏感染性基因組,其結(jié)構(gòu)模擬親本病毒粒子的構(gòu)象和組織,卻不能在細(xì)胞內(nèi)進行自我復(fù)制[26]。桿狀病毒是昆蟲的主要病原體,研究者構(gòu)建了重組桿狀病毒來共表達PPRV-H、N 和M 蛋白,可使昆蟲細(xì)胞膜上的VLP出芽增殖,同時發(fā)現(xiàn)這些VLP 還可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)大量的病毒特異性中和抗體,這表明基于VLP制成的疫苗具有抗PPRV 的潛力[27,28]。有研究發(fā)現(xiàn),僅M 蛋白的表達就足以組裝和釋放PPRV的VLP,單獨通過F 蛋白的表達也可支持低水平的VLP 裝配,但在不存在M 的情況下未觀察到VLP 的釋放,進一步突顯了M 蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白在VLP 裝配和釋放中的關(guān)鍵作用[23]。

    利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達VLP 已被證明是疫苗研發(fā)的有效策略,Engerix-B,Porcilis和Cervarix 等基于VLP 的疫苗已經(jīng)獲得商業(yè)化許可。基于VLP 制成的疫苗,通常是利用病毒疫苗株序列構(gòu)建的,然而,由于某些結(jié)構(gòu)蛋白翻譯后糖基化修飾的改變和遺傳物質(zhì)的缺乏,衍生自疫苗株的VLP 的免疫原性并不總是最佳,需要通過測定進行判斷。Yan 等[29]利用桿狀病毒對PPRVM、H 和F 蛋白表達后,產(chǎn)生了兩種PPRV VLP 候選毒株,分別來自Ⅳ系Tibet/30 毒株和Ⅱ系Nigeria 75/1 疫苗株;使用這些VLP 來免疫小鼠、山羊和綿羊,二次免疫后發(fā)現(xiàn)兩種PPRV 的VLP 都能夠在小鼠、山羊和綿羊體內(nèi)引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),與Nigeria 75/1 VLP 相比,Tibet/30毒株的VLP 表現(xiàn)出更大的免疫原性。以上研究表明兩種PPRV VLP 都是控制和根除PPR 的合適候選疫苗株,而Tibet/30 VLP 由于具有更大的免疫原性而成為最有前途的候選疫苗株。

    2 活載體疫苗

    2.1 痘病毒載體

    痘病毒因其基因組容量大、含有大量的非必需基因、可載入大片段的外源基因而被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因載體病毒疫苗。孫一瑞等[30]利用egfp報告基因和gpt篩選基因篩選純化了包含PPRV H 基因的重組綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPV),將其經(jīng)皮內(nèi)注射105.5TCID50免疫綿羊,結(jié)果顯示該疫苗能夠誘導(dǎo)綿羊產(chǎn)生高滴度的抗PPRV 特異性中和抗體,抗體陽轉(zhuǎn)率達100%,并且外源H 基因的插入并未影響親本病毒的復(fù)制,為研究PPR 新型痘病毒重組疫苗的研制提供了理論依據(jù)。Chen 等[31]研究制備了表達PPRV H和F 蛋白的重組羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)rCPV-PPRV-H 和rCPV-PPRV-F,發(fā)現(xiàn)相比于rCPV-PPRV-F,rCPV-PPRV-H 能誘導(dǎo)更強的PPRV 中和抗體,首次免疫rCPV-PPRV-H 后,羊群的血清轉(zhuǎn)化率大于80%,6 個月后進行二次接種,免疫效果更強,可保護山羊免受強毒株攻擊。Chandran 等[32]利用安卡拉病毒(MVA)構(gòu)建了兩種重組痘病毒MVA-F 和MVA-H,用105空斑形成單位(pfu)的MVA-F 和MVA-H 通過肌肉注射免疫山羊,結(jié)果顯示,該疫苗安全性較好,未出現(xiàn)不良反應(yīng),即使是免疫4 個月后的山羊依然具有抵抗PPRV 攻擊的能力。痘病毒載體疫苗盡管被發(fā)現(xiàn)具有相對的熱穩(wěn)定性,但并沒有激活最佳的抗體反應(yīng),此外,使用痘病毒載體重組疫苗時疫苗接種員的安全性也不容忽略。

    2.2 腺病毒載體

    腺病毒載體疫苗能誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng),這種T 細(xì)胞反應(yīng)通常是模擬了病原體誘導(dǎo)的保護性反應(yīng),最常用的為人5 型腺病毒(Ad 5)[33]。Ad 5 被認(rèn)為是一種較好的用于小型反芻動物的重組載體,由于動物對該種載體缺乏先天免疫力,因此可達到更好的免疫效果。

    研究發(fā)現(xiàn)將PPRV-H 和F 基因插入腺病毒載體構(gòu)建的Ad-H 和Ad-F 疫苗,對山羊進行單獨免疫和聯(lián)合免疫,均可誘導(dǎo)高效抗體和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答,但Ad-H 和Ad-F 聯(lián)合使用比Ad-H或Ad-F 單獨使用誘導(dǎo)的保護效果更好[34,35]。Holzer 等[36]為了確定表達PPRV-H、F 蛋白的Ad制成疫苗的最低劑量,對東非PPR 常發(fā)國家肯尼亞的山羊展開了研究,發(fā)現(xiàn)僅需107pfu 的Ad-H或108pfu 的Ad-F 就可保護機體不受野生型PPRV 的攻擊,同時還發(fā)現(xiàn)由108pfu(Ad-H+Ad-F)組成的疫苗可能對山羊提供無菌保護,并且聯(lián)合使用Ad-H 和Ad-F 比單獨使用Ad-H 具有更強的保護作用。Rojas 等[37]檢測到,在接種重組Ad 5 疫苗和感染PPRV 后觸發(fā)的CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)十分相似,在PPRV 強毒株攻擊下可激活A(yù)d 5-F 和Ad 5-H 疫苗誘導(dǎo)的CD4+、CD8+T 記憶細(xì)胞分化。這些研究表明使用表達PPRV 基因的重組腺病毒疫苗可在機體受到PPRV 攻擊后,誘導(dǎo)T 細(xì)胞大量增殖起到保護作用。

    有研究者對表達PPRV-F 和H 蛋白的重組雞痘病毒與Ad 5 載體疫苗進行了免疫效果比較,發(fā)現(xiàn)Ad 5 載體疫苗誘導(dǎo)了更高水平的病毒特異性抗體和中和抗體,并激發(fā)了更多數(shù)量的CD8+T細(xì)胞,同時還發(fā)現(xiàn),無論是否添加集落刺激因子或綿羊白細(xì)胞介素-2(IL-2),Ad-H 均能在免疫4個月后誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生較強的抗體和細(xì)胞免疫,并能完全保護山羊免受PPRV 強毒株的攻擊[38,39]。重組腺病毒載體疫苗具有高度免疫原性,可誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫,是能夠區(qū)別自然感染動物與疫苗接種感染動物的疫苗。

    3 核酸疫苗

    PPR 核酸疫苗是將編碼PPRV 抗原的基因制成疫苗,再接種到動物體內(nèi)使之可在機體內(nèi)進行表達,并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體,從而起到免疫的效果。核酸苗接種后與自然免疫相似,不存在毒力返強和散毒的風(fēng)險,是由于在激發(fā)機體細(xì)胞免疫的同時還激發(fā)了體液免疫。Wang 等2013年構(gòu)建了一種基于西門利克森林病毒(SFV)復(fù)制子的自殺DNA 疫苗,并測試了其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性的能力,首先將克隆的PPRV H 基因插入SFV復(fù)制子載體pSCA1 中,再將pSCA1-H 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK-21 細(xì)胞中,最后通過Western blot 來檢測表達蛋白的抗原性。將pSCA1-H 質(zhì)粒通過肌肉注射入BALB/c 小鼠體內(nèi),共注射3 次,每次間隔兩周,檢測結(jié)果表明pSCA1-H 可在BHK-21 細(xì)胞中表達H 蛋白,并且可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性抗體、中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[40];2015年又利用同樣的方法對表達PPRV-F 基因構(gòu)建的pSCA1-F 質(zhì)粒的抗原性進行了測試,結(jié)果表明pSCA1-F 也可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)同樣的反應(yīng),并且pSCA1-F 在初次免疫小鼠24 h 后,白細(xì)胞介素(IL-2、IL-10)含量不斷升高,干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)也從此時開始上升,之后逐漸下降,這種自殺性DNA 疫苗為PPR 新型疫苗的研發(fā)提供了新思路[41]。由此可見核酸苗具有同時引起細(xì)胞免疫和體液免疫的特性,還具有抗體產(chǎn)生制備周期短、效價高、儲存條件簡單等優(yōu)點。

    4 反向遺傳學(xué)技術(shù)重組苗

    反向遺傳學(xué)技術(shù)可從遺傳上改變病毒RNA組成,用于添加標(biāo)記基因(陽性標(biāo)記疫苗)或刪除抗原成分(陰性標(biāo)記疫苗),利用這種方法操控PPRV 基因組來引入特異性突變位點,從而為疫苗的研發(fā)提供了一種新的思路[42]。有研究者為了從血清學(xué)上區(qū)分野毒株和疫苗毒株,利用反向遺傳技術(shù)建立了帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的PPRV 重組疫苗,同時還構(gòu)建了表達PPRV-H 和F 基因的山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)活載體苗,這種情況下只需要對PPRV-H 或F 基因進行檢測就可有效區(qū)分疫苗株和野毒株,如果在注射過疫苗的動物體中檢測到H 或F 蛋白的抗體,那么證明其感染毒株為野毒株,反之則證明為免疫毒株感染,注射此種疫苗可同時預(yù)防PPRV 和SPV 的感染[43]。Muniraju 等[44]通過反向遺傳學(xué)技術(shù),利用PPRV Nigeria 75/1 疫苗株研發(fā)了一種rPPRV-C77 重組苗,注射山羊后沒有表現(xiàn)出任何不良反應(yīng),但是,該疫苗在PPRV 血凝素(H)包膜糖蛋白上缺乏C77 單克隆抗體的結(jié)合位點,對此需要進行更深入的研究。使用反向遺傳學(xué)方法研發(fā)的疫苗的一個潛在問題是,標(biāo)記蛋白可能會被整合到病毒的包膜中,因此可能會改變宿主的趨向性和致病性。

    各疫苗優(yōu)缺點具體見表2。

    表2 幾種疫苗的優(yōu)缺點

    5 展望

    動物在接種疫苗后由于接種時間、接種部位、母源抗體及疫苗配制時間等原因會造成不同的免疫效果[45]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),90 日齡以上的羊群免疫后抗體合格率和抗體水平最高,具有母源抗體的羔羊100 日齡為最佳免疫時間;頸部皮下注射優(yōu)于肌肉注射,但兩者均能獲得一定水平的免疫效果。魯立柱等[46]對初免21 d 后羊群進行了第二次免疫,同時監(jiān)測不同時間血清中抗體濃度,結(jié)果顯示,初免21 d 抗體滴度平均可達5.18±2.87;二次免疫后3、7、14、21 d 平均滴度分別為5.65±2.56、6.95±1.82、7.28±1.18、8.12±1.31,呈上升趨勢,試驗表明,對已經(jīng)有PPR 抗體的羊進行二次免疫可增強免疫效果。嚴(yán)斯剛等[47]為測試PPRV 疫苗配置后不同時間接種的免疫效果,將疫苗配置后1、1~2、2~3、5~6 h 分別免疫本地山羊,并在接種后當(dāng)天和30、120 d 分別測定抗體水平,結(jié)果顯示前三組在30 d 和120 d 抗體阻斷率均在85%以上,表明稀釋后的疫苗在3 h 內(nèi)用完均有良好的免疫效果。

    由于內(nèi)蒙古地區(qū)得天獨厚的生態(tài)環(huán)境和我國畜牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展,蒙東地區(qū)肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛,個別養(yǎng)殖企業(yè)由于飼養(yǎng)管理體系、防疫體系不健全導(dǎo)致一些羊源病毒性疾病頻繁發(fā)生,給個體養(yǎng)殖戶及大型養(yǎng)殖場均造成了一定的經(jīng)濟損失。但到目前為止,還未研發(fā)出一種各方面都完美的疫苗,其中應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)弱毒苗和滅活苗無法將接種疫苗的動物與自然感染的動物區(qū)分開來,而基因工程苗有實現(xiàn)這一目標(biāo)的可能。減毒活疫苗免疫效果好卻不耐熱,需要健全的冷鏈運輸系統(tǒng)送到現(xiàn)場,故還需要研發(fā)一種熱穩(wěn)定性疫苗,但技術(shù)及基因工程苗在研發(fā)上還存在一些問題,需要更深入的探索。此外,還應(yīng)研發(fā)氣霧劑、滴眼液疫苗,為大規(guī)模免疫提供方便。防止病毒傳播所需的群體免疫水平為80%,然而,阻止PPR 有效傳播所需的確切群體免疫水平需要進一步研究。綜上所述,新興的PPR 基因工程疫苗和減毒活疫苗在實驗室研究中取得了飛躍性進展,為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),但研制安全高效的疫苗仍存在很多問題,如病毒的易變異性、保護性抗原的不確定性、活載體的不穩(wěn)定性、免疫效果的評價指標(biāo)不健全等,這將導(dǎo)致未來PPR 疫苗的發(fā)展仍然艱辛。

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