不同皮色洋蔥花青素合成酶基因片段的克隆及苗期表達(dá)分析

王振寶，徐宏志，劉冰江，霍雨猛，孫亞玲，李艷偉，吳雄，楊妍妍

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山東 濟(jì)南 250100；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

洋蔥(Allium cepaL.)又名圓蔥、蔥頭、球蔥等，為百合科蔥屬二年生草本植物。洋蔥于近代傳入我國，由于具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貯藏和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)，在我國廣泛栽培，是一種重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[1]。洋蔥以肉質(zhì)鱗莖為主要食用器官，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有“蔬菜皇后”的美譽(yù)；洋蔥中含有的類黃酮、有機(jī)硫等還有一定的藥用和保健作用，其中類黃酮具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血栓形成、消炎等作用[2]。

鱗莖顏色是洋蔥的一個重要性狀，主要有紫、紅、黃、白等顏色。類黃酮類化合物是洋蔥鱗莖產(chǎn)生不同顏色的主要因素。花青素作為一種重要的類黃酮類天然水溶性色素，廣泛分布于植物細(xì)胞液中，是植物花、果實(shí)和儲藏器官等呈現(xiàn)不同顏色的主要色素之一[3]。植物花青素生物合成途徑的研究已較為成熟，是以直接前體苯丙氨酸為底物，經(jīng)過一系列酶的催化，最終形成穩(wěn)定的花色苷[4]。花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)位于花青素生物合成途徑的倒數(shù)第二步，是花青素生物合成途徑末端的限速酶，能催化無色花色素轉(zhuǎn)化為有色花色素，其表達(dá)水平的高低會影響植物組織器官中花色苷的累積，從而產(chǎn)生不同的顏色[5]。

目前，已經(jīng)從花生、黑稻、蘋果、東方百合等多種植物中克隆了ANS基因[6－9]，而且研究發(fā)現(xiàn)ANS基因的表達(dá)具有組織特異性和品種特異性，如黑果枸杞果實(shí)中LrANS基因的表達(dá)量顯著高于其他組織，表達(dá)量由高到低依次為黑果、紫果、綠果、花、葉、莖、根[10]；紫心甘薯塊根、莖、葉中ANS基因的表達(dá)水平顯著高于白心甘薯[11]。但有關(guān)洋蔥ANS基因的研究相對較少，繆軍等[12]2010年克隆了洋蔥花青素合成酶基因AcANS，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；Kim等[13]2016年鑒定出了2 個突變的ANS等位基因，能造成洋蔥花青素合成酶失活，從而影響花青素合成。本研究以30 天苗齡的紫皮和黃皮洋蔥幼苗為試材克隆ANS基因片段，并對其在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行研究，以期為洋蔥ANS基因全長序列獲得和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為紫皮洋蔥育種系175F 和黃皮洋蔥育種系DH17－1 的30 天苗齡幼苗，均定植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地。于2021年10月13 日分別取幼苗的新鮮根、葉鞘和葉片，迅速放入液氮中冷凍，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 洋蔥總DNA、總RNA 的提取及cDNA 制備

洋蔥基因組總DNA 采用快捷型植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，具體操作參照說明書。

洋蔥總RNA 采用Trizol(Invitrogen 公司)法提取，參照說明書進(jìn)行操作。取完整性良好的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶生物工程大連有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 PCR 擴(kuò)增

分別以洋蔥基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板擴(kuò)增洋蔥花青素合成酶基因片段。所用目的基因上游引物AcANS－F 序列為5′－CTAACGATCAATCTAAAGGGA － 3′， 下游引物AcANS－R 序列為5′－GCAGTATGAACGATAAGGCAC－3′，由青島蔚來生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，其中，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測，并拍照記錄。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送青島蔚來生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

利用DNAMAN 和Blast(http:/ /www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對分析。

1.5 基因表達(dá)量測定

分別從兩種皮色洋蔥幼苗的根、葉鞘和葉片中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以Actin為內(nèi)參[14]，上游引物AcActin－F 序列為5′－ACACGGCCTGGATAGCAACAT－3′，下游引物AcActin－R序列為5′－AGAGCAGTATTCCCAAGCATT－3′，由青島蔚來生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系參照1.3，通過PCR 擴(kuò)展產(chǎn)物條帶的亮度將cDNA 模板調(diào)整為基本一致的濃度，擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測，并拍照記錄。然后用基因特異引物AcANS－F 和AcANS－R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上，擴(kuò)增30 或35 個循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcANS 基因片段克隆

根據(jù)已報(bào)道的花青素合成酶基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以紫皮和黃皮洋蔥的基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出1 條特異條帶(圖1)。以基因組DNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴(kuò)增出約510 bp 的目的片段，與預(yù)期片段大小相吻合；以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴(kuò)增出約400 bp 的目的片段。分別將目的片段回收測序。

圖1 不同皮色洋蔥幼苗中AcANS 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 AcANS 基因片段序列比對分析

經(jīng)測序分析和Blast 比對，克隆到的目的基因片段序列與已報(bào)道的洋蔥ANS等位基因序列的相似度均在97%以上，確認(rèn)為AcANS基因片段。利用DNAMAN 軟件對從兩種皮色洋蔥中克隆的AcANS基因片段序列進(jìn)行對比分析，由圖2 可以看出，克隆得到的兩種皮色洋蔥的AcANS基因組序列長度均為497 bp，堿基序列也完全一致，不存在多態(tài)性位點(diǎn)；兩種皮色洋蔥AcANS基因的編碼序列長度均為390 bp，堿基序列也完全一致，且編碼區(qū)包含一個107 bp、符合GT－AG 規(guī)則的內(nèi)含子。表明克隆得到的兩種皮色洋蔥AcANS基因完全一致，且無多態(tài)性位點(diǎn)。

圖2 不同皮色洋蔥AcANS 基因組序列與編碼序列比對結(jié)果

2.3 不同皮色洋蔥AcANS 基因的組織表達(dá)特性

以Actin基因作為內(nèi)參，采用半定量RT－PCR對紫皮和黃皮洋蔥幼苗根、葉鞘、葉片中的AcANS基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果(圖3)顯示，兩種皮色洋蔥的AcANS基因均表現(xiàn)為葉鞘中表達(dá)量最高，葉片中次之，根中不表達(dá)；在相同條件下，紫皮洋蔥葉鞘和葉片中AcANS基因的表達(dá)量明顯高于黃皮洋蔥，且在擴(kuò)增30 個循環(huán)時(shí)，紫皮洋蔥葉鞘中可以檢測到AcANS基因的表達(dá)，而黃皮洋蔥中未檢測到。說明洋蔥苗期AcANS基因的表達(dá)具有組織特異性，后期顏色越深的部位AcANS基因的表達(dá)量越高，而且紫皮洋蔥中AcANS基因的表達(dá)量更高，這為后期鱗莖顏色不同奠定了基礎(chǔ)。

圖3 AcANS 基因在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

花色苷的合成需要PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等結(jié)構(gòu)基因的參與[4]，這些基因的表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)都可以造成植物組織器官中花色苷的累積，從而產(chǎn)生顏色上的差異?；ㄇ嗨睾铣擅?ANS)可以催化無色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素[15]。ANS基因的表達(dá)與花青素的累積量呈正相關(guān)，顏色越深或越鮮艷的組織部位中ANS基因的表達(dá)量越高[15－17]。本研究結(jié)果也表明，AcANS基因在洋蔥幼苗的葉鞘中表達(dá)量最高，其次是葉片中，根中不表達(dá)，而且紫皮洋蔥中的表達(dá)量明顯高于黃皮洋蔥，這為后期鱗莖產(chǎn)生顏色上的差異奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

花青素合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子和外界環(huán)境因素的共同調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH 和WD40 三大類[18]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是植物花青素合成途徑最廣泛的調(diào)節(jié)因子，也是花青素生物合成中MBW 復(fù)合物的主要調(diào)控因子，能夠正、負(fù)調(diào)控植物花青素的合成。如在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)PsMYB58基因能夠顯著上調(diào)煙草花青素生物合成途徑中ANS等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[19]；在水仙中過表達(dá)NtMYB2基因能夠抑制水仙花青素生物合成途徑各結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[20]。此外，MYB 轉(zhuǎn)錄因子還可以與其它轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、WD40 等共同作用，形成MBW 復(fù)合物，調(diào)控花青素的合成。本研究分別克隆了紫皮、黃皮洋蔥的AcANS基因片段，序列比對結(jié)果表明兩個片段不論基因組序列還是編碼序列都完全一致，也不存在多態(tài)性位點(diǎn)，并且AcANS基因在兩種皮色洋蔥中均能正常轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異，在紫皮洋蔥中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于黃皮洋蔥，推斷這種差異的產(chǎn)生可能是MYB 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的結(jié)果，因此，后續(xù)有必要克隆洋蔥MYB 轉(zhuǎn)錄因子，研究其與AcANS基因以及花青素生物合成途徑其他結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系。

洋蔥定植前很難通過幼苗準(zhǔn)確判斷后期蔥球的顏色，而實(shí)際生產(chǎn)中，在種子或幼苗階段就能鑒定出皮色對于洋蔥種子純度檢測及種質(zhì)資源鑒定具有重要意義。吳雄等[21]對洋蔥花蕾期可育群體和不育群體進(jìn)行cDNA－SRAP 分析獲得了差異表達(dá)片段，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了可以鑒定洋蔥細(xì)胞核育性恢復(fù)基因的cDNA 分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記僅在恢復(fù)系花蕾中存在擴(kuò)增，而其它組織部位和育性材料中均不存在擴(kuò)增，可以有效鑒定洋蔥恢復(fù)系材料。鑒于此，本研究利用AcANS基因表達(dá)水平的差異，以30 天苗齡紫皮、黃皮洋蔥葉鞘cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增30 個循環(huán)時(shí)，所有紫皮洋蔥中均有特異性擴(kuò)增片段，而黃皮洋蔥中無擴(kuò)增，因此可以作為cDNA 分子標(biāo)記用于在洋蔥30 天苗齡時(shí)判斷后期蔥球的顏色，與傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定相比所需時(shí)間短、用地少、成本低、在苗期即可達(dá)到鑒定種子純度的目的，可應(yīng)用于洋蔥種質(zhì)資源鑒定和輔助育種等方面。

本研究克隆了不同皮色洋蔥AcANS基因部分基因組序列和編碼序列，為全長基因序列的克隆奠定了基礎(chǔ)；分析了AcANS基因在兩種皮色洋蔥幼苗各組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有明顯的組織特異性和品種特異性，這為進(jìn)一步弄清洋蔥鱗莖不同皮色發(fā)生的分子機(jī)制提供了參考。另外發(fā)現(xiàn)，可利用不同皮色洋蔥葉鞘中AcANS基因表達(dá)水平的差異作為cDNA 分子標(biāo)記，在30 天苗齡時(shí)就區(qū)分出紫皮和黃皮洋蔥。