糖基化反應(yīng)條件對豌豆蛋白乳化特性的影響

馬露燕，郭興鳳，朱婷偉，田亞東，段曉杰

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

植物蛋白質(zhì)作為一種來源廣泛的天然食品級大分子，因其具有獨特的界面特性、良好的乳化特性使其在乳液體系構(gòu)建研究過程中得到了人們的廣泛關(guān)注[1]。尤其是豌豆蛋白營養(yǎng)價值高，且不含過敏原，成為近年來一種新興的優(yōu)質(zhì)植物蛋白來源[2-3]。但豌豆蛋白在大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)時功能性質(zhì)（乳化性、溶解性等）會變差，因而僅作為副產(chǎn)物，造成豌豆蛋白資源的浪費(fèi)[4]。要解決豌豆蛋白的局限性，進(jìn)一步提高其營養(yǎng)和加工應(yīng)用價值，需進(jìn)一步對豌豆蛋白進(jìn)行改性。研究表明，蛋白質(zhì)和糖經(jīng)過糖基化反應(yīng)，可提高蛋白質(zhì)溶解度，且蛋白質(zhì)-多糖結(jié)合物能表現(xiàn)出更好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[5-7]，其優(yōu)良的乳化性能歸因于兩者優(yōu)異的兩親性[8]。且該方法不需要提供特殊裝置，相對簡單、安全、綠色，在功能性蛋白制品生產(chǎn)中有很大的發(fā)展空間[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）和乳糖在相對濕度79%，溫度60℃條件下發(fā)生干法糖基化反應(yīng)，制備不同接枝度的SPI-乳糖共價復(fù)合物，反應(yīng)24 h后復(fù)合物的溶解性和乳化特性明顯提高[11]。因此，有望通過糖基化改性來改善豌豆蛋白的乳化特性。

在糖基化反應(yīng)過程中，糖基供體的選擇及反應(yīng)條件都會影響糖基化產(chǎn)物的功能特性。在糖基供體選擇中，低聚木糖一方面可通過糖基化改性修飾蛋白結(jié)構(gòu)來改善蛋白質(zhì)的功能特性；另一方面也可作為益生元被人體腸道中的細(xì)菌發(fā)酵利用，選擇性地促進(jìn)腸道益生菌的生長，進(jìn)而有益于機(jī)體健康[12-13]。此外，糖基化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)與低聚糖的糖基化速度比多糖快得多，其可作為多糖的良好替代品[14]?；诖?，本文利用低聚木糖通過糖基化修飾豌豆蛋白，以乳化特性為評判指標(biāo)，優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件。研究蛋白質(zhì)與糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等條件對糖基化復(fù)合物乳化特性的影響；并通過響應(yīng)面法對反應(yīng)條件進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得低聚木糖糖基化下乳化特性較好的豌豆蛋白糖基化復(fù)合物的制備條件，以期為豌豆蛋白在乳液體系中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白（蛋白質(zhì)含量≥85%）、低聚木糖（≥95%，食品級）：西安金碩果業(yè)有限公司；大豆油：益海（周口）糧油工業(yè)有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（≥99%，分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水：河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院8349實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

可見光分光光度計（722S型）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速剪切均質(zhì)機(jī)（GL-20C型）：上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6型）、磁力攪拌器（JJ-6A型）：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆蛋白-低聚木糖糖基化復(fù)合物的制備

參考文獻(xiàn)[15]采用濕法糖基化方法，將豌豆蛋白與低聚木糖按一定的質(zhì)量比溶解于蒸餾水中，并保持蛋白濃度為1%，磁力攪拌2 h混勻，調(diào)節(jié)pH值為7，于4℃冰箱中放置過夜，使其充分水合。將樣品放置在75℃水浴鍋中反應(yīng)90 min，取出在冰水中冷卻5 min，以終止反應(yīng)，得到糖基化產(chǎn)物。

1.3.2 乳化特性的測定

參考文獻(xiàn)[16]測定糖基化產(chǎn)物的乳化特性：取15mL糖基化樣品溶液，加入5 mL大豆油混合后進(jìn)行剪切[室溫（25 ℃）、12 000 r/min、2 min]處理。剪切處理后分別在0、10 min從底部取樣50 μL，加入5 mL 0.1%SDS，測定500 nm處的吸光值，以SDS溶液為空白。乳化活性計算公式如下。

式中：A500為500 nm處的吸光值；N是稀釋倍數(shù)；Φ是體系中油相所占體積分?jǐn)?shù)；C是蛋白質(zhì)的濃度，g/mL；L是比色皿光徑，1 cm。

乳化穩(wěn)定性計算公式如下。

式中：A0為0min的吸光值；A10為10min的吸光值。

1.3.3 豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比對豌豆蛋白乳化特性的影響

調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，反應(yīng)溫度為70℃，控制糖基化反應(yīng)時間為90 min，調(diào)控豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比分別為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，測定不同豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。

1.3.4 反應(yīng)溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響。

調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比為2∶1，糖基化反應(yīng)時間為90 min，調(diào)控反應(yīng)溫度分別為70、80、90、100℃，測定不同反應(yīng)溫度下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。

1.3.5 反應(yīng)時間對豌豆蛋白乳化特性的影響

調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比為2∶1，反應(yīng)溫度為80℃，調(diào)控糖基化反應(yīng)時間分別為30、60、90、120 min，測定不同反應(yīng)時間下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比3個因素為自變量，以產(chǎn)物的乳化特性為響應(yīng)值設(shè)計試驗，研究各自變量及其交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，進(jìn)一步優(yōu)化低聚木糖糖基化豌豆蛋白改性工藝的最佳參數(shù)。

設(shè)計類型為三因素三水平共17個試驗點，其中5個為中心試驗，12個為析因試驗，利用Design Expert 8.0.6對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合及方差分析，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20、Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖及顯著性分析，顯著性水平設(shè)為0.05。采用Design Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對豌豆蛋白乳化特性的影響

2.1.1 豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比對豌豆蛋白乳化特性的影響

在豌豆蛋白濃度為1%，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為90 min時，豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖1所示。

圖1 豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.1 Effect of mass ratio of pea protein to xylooligosaccharide on emulsifying properties of modified pea protein

由圖1可知，隨著豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比的增加，豌豆蛋白糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在一定的豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比下，溶液黏性可使糖分子與蛋白質(zhì)分子接觸機(jī)會增大，糖基化反應(yīng)順利進(jìn)行；低聚木糖附著在蛋白質(zhì)表面增加了空間位阻，因此油滴不易聚集和凝結(jié)，從而表現(xiàn)出糖基化產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性提高[17]。當(dāng)糖分子過多，溶液黏性隨之增加，反而不利于糖基化反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致乳化特性較差[18]?？梢娺m當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)與糖的質(zhì)量比有利于獲得乳化特性較好的糖基化產(chǎn)物。因此，確定豌豆蛋白與低聚木糖的質(zhì)量比為2∶1，此時糖基化產(chǎn)物具有高的乳化特性，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為10.34 m2/g和61.75%。

2.1.2 反應(yīng)溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響

在豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比為2∶1，反應(yīng)時間為90 min時，反應(yīng)溫度對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on emulsifying properties of modified pea protein

由圖2可知，整體上，隨著反應(yīng)溫度的升高，糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度在80℃時，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化特性(乳化活性12.3 m2/g，乳化穩(wěn)定性70.15%)，不同反應(yīng)溫度的乳化穩(wěn)定性無顯著性差異，故以乳化活性最高為最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度是影響糖基化反應(yīng)進(jìn)程的一個重要指標(biāo)，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，使蛋白質(zhì)變性伸展，多肽鏈被解聚成小分子肽和游離氨基酸，加快了糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，使乳化活性升高；反應(yīng)溫度過高時，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，不利于糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合[19]。

2.1.3 反應(yīng)時間對豌豆蛋白乳化特性的影響

當(dāng)豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比為2∶1，反應(yīng)溫度為70℃時，反應(yīng)時間對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時間對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.3 Effect of reaction time on emulsifying properties of modified pea protein

由圖3可知，在0～120 min的反應(yīng)時間段，隨著反應(yīng)時間的延長，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是由于隨著反應(yīng)時間的延長，糖和蛋白質(zhì)不斷結(jié)合，乳化活性隨之提高，而反應(yīng)時間過長，更多的親水性糖分子附著在豌豆蛋白上，這會相應(yīng)地降低乳化活性[20]。當(dāng)反應(yīng)時間為60 min時，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化活性，乳化穩(wěn)定性無顯著變化，此時乳化活性為11.83 m2/g；乳化穩(wěn)定性為56.20%。

2.2 最佳反應(yīng)條件的確定

在反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比（C）單因素研究的基礎(chǔ)上，以乳化特性（乳化活性和乳化穩(wěn)定性）為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計方案，具體設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2。同時對結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果如表3和表4所示。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

表3 乳化活性回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of emulsifying activity regression model

表4 乳化穩(wěn)定性回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of emulsifying stability regression model

以反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比（C）為自變量，通過對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析得到乳化活性（Y1）、乳化穩(wěn)定性（Y2）和反應(yīng)條件之間的二次多項式回歸方程分別為Y1=-23.567 04+0.692 45A+0.107 12B+4.843 50C-0.000 305AB-0.006AC-0.017 7BC-0.004 315A2-0.000 306 4B2-0.651C2，R2=0.962 1；Y2=-65.164 68+2.2648 0A+0.721 66B+0.721 66C-0.004 562 5AB+0.145 87AC-0.111 15BC-0.014 364A2-0.000 786 3B2-2.935 75C2，R2=0.967 7。其中，由模型擬合F檢驗值可知，乳化活性F=19.72，P 值=0.000 4<0.01，乳化穩(wěn)定性 F=23.29，P值=0.000 2<0.01，說明該模型擬合性較好，達(dá)到顯著水平；同時，失擬項：乳化活性F=3.31，P值=0.139 1>0.05，乳化穩(wěn)定性 F=1.67，P 值=0.309 5>0.05，模型失擬性檢驗不顯著。去掉對乳化活性影響不顯著的交互因素 AB、AC 后模型 R2=0.948 5、調(diào)整 R2=0.908 5、預(yù)測R2=0.772 8、變異系數(shù)=4.02。對于乳化穩(wěn)定性模型R2=0.967 7、調(diào)整 R2=0.926 1、預(yù)測 R2=0.690 1、變異系數(shù)=2.93。結(jié)果表明該模型擬合度好，可以很好地對響應(yīng)值（乳化特性）進(jìn)行預(yù)測。

由表3和表4得到的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可得，選取的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比3個因素對豌豆蛋白糖基化復(fù)合物的乳化特性有重要影響。對一次項回歸系數(shù)的絕對值大小排序，可得乳化活性中3個因素的影響順序為C>A>B，乳化穩(wěn)定性3個因素的影響順序為C>B>A。此外，交互作用中，一次項A、B、C，交互項BC，二次交互項A2、B2對改性豌豆蛋白乳化活性影響極顯著，二次項C2影響顯著。一次項B、C，交互項AB、AC、BC，二次交互項A2、C2對改性豌豆蛋白乳化穩(wěn)定性影響極顯著，二次項B2影響顯著。這說明各因素對糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響不是簡單的線性關(guān)系。

為進(jìn)一步研究各因素之間交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行各因素之間的交互作用響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 各因素交互作用對乳化活性影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying activity

圖5 各因素交互作用對乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying stability

圖4直觀反映出蛋白-糖質(zhì)量比和反應(yīng)時間對豌豆蛋白乳化活性的影響，當(dāng)豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比固定時，乳化活性隨著反應(yīng)時間的增加呈先升高后降低的趨勢；圖5直觀反映出各影響因素交互作用對乳化穩(wěn)定性的影響，當(dāng)豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比不變時，乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。

2.3 最佳工藝條件驗證

試驗表明，豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間均可影響糖基化反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)而影響糖基化產(chǎn)物乳化特性的變化。采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行模型預(yù)測，預(yù)測工藝條件為反應(yīng)溫度74.63℃、反應(yīng)時間93.65 min、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比1.86∶1，預(yù)測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.13 m2/g、乳化穩(wěn)定性為60.44%。根據(jù)實際試驗條件，在反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時間90 min、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比2∶1條件下測得乳化活性為12.32 m2/g、乳化穩(wěn)定性為59.64%，調(diào)整后預(yù)測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.19 m2/g、乳化穩(wěn)定性為60.16%。實際值與預(yù)測理論值接近，說明此模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本試驗以豌豆蛋白與低聚木糖為原料，采用濕法糖基化方法制備豌豆蛋白-低聚木糖復(fù)合物。通過單因素試驗和響應(yīng)面法建立糖基化復(fù)合物制備條件（豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間）的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)回歸方程分析及預(yù)測模型，得到最佳制備工藝條件。整體上，模型擬合度好，可以很好地對反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性進(jìn)行預(yù)測。這3個因素對豌豆蛋白乳化活性影響大小為豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間；對乳化穩(wěn)定性影響大小為蛋白-糖比例>反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度。最佳工藝條件為反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時間90 min、豌豆蛋白與低聚木糖質(zhì)量比2∶1，測得乳化活性為12.32 m2/g、乳化穩(wěn)定性為59.64%。該研究將為豌豆蛋白在乳液體系中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。