功能性低聚糖的生物活性及其生物制造

姜金池，楊晶晶，杜濤，鄧榮，高晶東，王梓怡，崔潔，米利，楊文革，周彬，胡永紅*

（1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211816；2.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；3.南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京 211816；4.江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇 無錫 214151）

低聚糖是指2個～10個糖苷鍵聚合而成、分子量介于單糖和多糖之間的糖類化合物[1]。功能性低聚糖不僅具有糖類的一般性質，還具有特殊的生理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑菌等功能[2]，有些功能性低聚糖還具有促進腸道內雙歧桿菌增殖、調節(jié)腸道內菌群豐度等功能[3]。

大量的研究結果表明，低聚糖大多來源于植物。裴志勇等[4]從地黃中提取地黃低聚糖（rehmannia glutinosa oligosaccharides，RGOs）與脂肪組織來源的干細胞進行聯(lián)合，探究其對小型豬急性心肌梗死的影響，結果表明RGOs能夠改善小型豬的心功能，促進小型豬心肌梗死的治療。周靜[5]從黨參中提取高抗氧化活性的低聚糖，并通過衰老大鼠模型對其抗衰作用及機制進行研究，結果表明黨參低聚糖能夠顯著提高血清中的過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSC-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性。綜上所述，不同的植物含有各自特定的低聚糖組分，并且不同來源低聚糖的生理活性也有顯著差異。

由于功能性低聚糖具有低甜度、高溶解性的特點，因此常被作為甜味劑添加至乳制品、烘焙食品、功能飲料中。此外，還有文獻報道功能性低聚糖具有抗菌特性和抗氧化活性，因此可作為防腐劑、飼料和食用涂料的重要原料之一[6]。

本文以褐藻寡糖和果膠寡糖為例，從兩種寡糖的分子結構、生物活性以及生物制造方法，匯總這兩種寡糖的研究進展，并對其未來的發(fā)展方向進行展望。

1 褐藻寡糖

褐藻寡糖（aliginate oligosaccharide，AOS）是由褐藻膠降解得來的低聚糖，聚合度通常為2～25。褐藻寡糖作為一種典型的海洋寡糖，因其具有多種生物活性，近些年已成為功能性低聚糖的一大研究熱點[7]。

1.1 褐藻寡糖的生物活性

目前的研究表明，褐藻寡糖可通過抗炎、抑菌、抗氧化等方式，達到促進植物生長、防治病蟲害的功效。因此，需要對褐藻寡糖的生物活性進行系統(tǒng)研究匯總。

1.1.1 抗氧化活性

近年來，多項研究證實褐藻寡糖作為一種有效的自由基清除劑，可以通過降低機體脂質過氧化物的含量達到抗氧化的目的[8]。

包華芳等[9]利用酶解制備得到的褐藻寡糖來研究其抗氧化活性，結果表明褐藻寡糖的抗氧化活性與還原糖的含量密切相關；張明杰等[10]通過高效酶法制備了低分子量褐藻寡糖，評價其抗氧化活性，結果發(fā)現低分子量褐藻寡糖比高分子量褐藻寡糖具有更高的自由基清除活性；Yang等[11]研究了褐藻寡糖對草魚肝臟脂肪代謝的改善能力及抗氧化活性，結果表明褐藻寡糖可以通過提高肝臟的抗氧化能力，進而減少脂肪積累和肝臟細胞的凋亡。

1.1.2 抗腫瘤活性

近年來，多項研究報道褐藻寡糖具有一定的抗腫瘤活性，因此明確褐藻寡糖和腫瘤分子的機制和結構-功能關系是十分有必要的。

Chen等[12]研究了聚合度為2～5的褐藻寡糖對抗骨肉瘤的作用。結果發(fā)現聚合度為5的褐藻寡糖顯著抑制了骨肉瘤細胞的生長，血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性明顯提高，而血清中的白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平明顯降低，說明褐藻寡糖的抗腫瘤活性與其結構密切相關。

1.1.3 抗炎活性

炎癥是機體抵抗病原體入侵的重要防御機制，多項研究發(fā)現褐藻寡糖還具有抗炎活性，可以激活機體的先天免疫細胞。Wang等[13]通過斷奶仔豬腸炎模型研究褐藻寡糖的抗炎效果，結果表明褐藻寡糖可通過抑制NOD1/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎功效。史旭陽[14]通過氧化降解法得到褐藻膠寡糖，并且通過細胞炎癥模型發(fā)現褐藻寡糖能通過抑制細胞因子、一氧化氮以及環(huán)氧合酶、誘導型一氧化氮合酶的表達，發(fā)揮抗炎活性的功效。

1.1.4 抑菌活性

多項研究的結果表明褐藻寡糖具有抑菌活性。An等[15]通過褐藻酸裂解酶制備了聚合度為6～8的褐藻寡糖，結果表明褐藻寡糖對銅綠假單胞菌的生長具有抑制作用。竇勇等[16]主要研究聚合度為10以下的寡糖對7種常見細菌和真菌的抑菌作用，結果證明褐藻寡糖可以顯著抑制細菌和真菌的生長繁殖。吳國鋒等[17]通過過氧化氫法制備褐藻膠寡糖，并研究不同條件制備的寡糖對啤酒污染菌的抑制作用，結果表明褐藻膠寡糖可有效抑制啤酒污染菌的生長。

1.2 褐藻寡糖的生物制造

褐藻寡糖的制備方法主要有物理法、化學法及生物法。物理法是利用微波、超聲或輻射法對褐藻膠進行降解，但該方法往往只能得到聚合度不一的褐藻寡糖混合物，導致降解物活性較差。化學法主要包括酸降解法、有機合成法等，但存在產物聚合度不均、化學殘留的問題。生物法主要包括酶促降解法、酶促合成法、產酶微生物發(fā)酵法等，能夠保護反應底物的活性基團，產生的褐藻寡糖聚合度可控、分子量小、安全，因此可以有效避免物理法、化學法的不足。

1.2.1 褐藻裂解酶的種類

褐藻膠裂解酶有多種分類方式[18]。根據作用方式分為內切酶和外切酶；根據分子質量分為20 kDa～35 kDa的褐藻膠裂解酶、40 kDa的褐藻膠裂解酶、60 kDa的褐藻膠裂解酶；根據序列相似性分為Poly-M特異性裂解酶、Poly-G特異性裂解酶、雙功能裂解酶。根據底物特異性，可以分為1，4-β-D-聚甘露糖醛酸裂酶和1，4-α-L-聚古羅糖醛酸裂解酶。

1.2.2 褐藻裂解酶的改造研究

1.2.2.1 高產褐藻膠裂解酶菌株的篩選

微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源之一，因此首先需要篩選出高產褐藻膠裂解酶菌株。孟青等[19]從海泥樣品中篩選得到一株高產褐藻膠裂解酶的菌株，該菌株所產的褐藻膠裂解酶主要降解褐藻膠內古羅糖醛酸片段，且產物聚合度較單一；劉海超[20]使用透明圈法篩選出1株高酶活的褐藻膠降解菌株——弧菌屬，通過優(yōu)化發(fā)酵條件等方式將其酶活提高了38.5%；趙婉琳等[21]篩選到1株能降解褐藻膠的?？曝愄厥暇?，經優(yōu)化后酶活提高至68.5 U/mL。

1.2.2.2 基因工程改造

采用基因工程技術對基因進行分子修飾及異源表達可以有效提高酶活力和產酶量，因此用基因工程技術構建裂解酶高產菌株也成為一個重要手段。李世昂[22]通過克隆溶藻弧菌內產褐藻膠裂解酶的基因構建出體外表達的重組菌株，再對其進行異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導表達。Rahman等[23]從海螺消化道克隆表達了PL-14家族的海藻酸裂解酶LbAly28，并發(fā)現重組酶對海藻酸鈉和聚鎂嵌段底物都有很強的活性。陳琳等[24]通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術獲得羊鮑腸道中弧菌的褐藻膠裂解酶基因val1，在大腸桿菌中進行異源表達，研究結果表明val1基因是PL7家族中一種具有較強耐冷性的褐藻膠裂解酶。

2 果膠寡糖

果膠寡糖是由果膠通過果膠酶降解得到的產物，具有抗氧化、改善腸道健康、抗腫瘤等多種活性。

2.1 果膠寡糖的作用

2.1.1 抗氧化活性

果膠寡糖的抗氧化活性主要是通過清除DPPH自由基、羥自由基來保護血管和抑制血清中丙二醛的合成。丁鵬等[25]通過酶法制備了黑莓果膠寡糖，結果表明黑莓果膠寡糖對自由基有很好的清除作用。Li等[26]從山楂果膠中提取了聚合度為5的山楂果膠寡糖，結果表明這種山楂果膠寡糖具有顯著的抗氧化活性。

近年來果膠寡糖的抗氧化活性也被應用于食品保鮮研究。陶璐等[27]探究了不同濃度的山楂果膠寡糖對香菇的保鮮效果，結果表明果膠寡糖能夠顯著減少香菇在儲藏過程中維生素C、還原糖和總酚含量的損失。

2.1.2 腸道改善活性

果膠寡糖由半乳糖醛酸和中性糖組成，多項研究表明果膠寡糖可以通過改變腸道菌群進而改善腸道健康。

Hu等[28]探究柑橘果膠寡糖對膽固醇代謝和腸道菌群的調節(jié)作用，結果表明果膠寡糖能夠顯著降低小鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC），顯著增加小鼠腸道內雙歧桿菌的數量，并且低密度膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量明顯比對照組降低。由于果膠寡糖的種類較多，不同果膠酶降解的產物在甲基化程度、甲酯化程度、聚合度以及結構組成上均有很大的差異，不同類型的果膠寡糖對雙歧桿菌的增殖作用也存在差異。

2.1.3 抗腫瘤活性

大量研究表明，果膠寡糖可能通過兩種途徑來抑制腫瘤的生長，一是改變細胞膜的通透性，二是增加半乳糖凝集素-3的分泌。Mallikarjuna等[29]從燕子根果膠多糖中提取出燕子根果膠寡糖，該種果膠寡糖通過減少半乳糖凝集素-3的凝集和抑制下游控制凋亡的關鍵蛋白survivin的mRNA表達，進而抑制腫瘤的生長。Kapoor等[30]從酸生番茄果膠中提取出果膠寡糖并研究其抗癌作用，結果表明酸生番茄果膠寡糖可通過抑制半乳糖-3的活性，進而抑制癌細胞的生長；Olano-Martin等[31]發(fā)現果膠寡糖可加速結腸癌細胞HT29萎縮和死亡進而抑制腫瘤的形成。

2.2 果膠寡糖的生物制造

果膠寡糖主要是通過酶法制造獲取，主要途徑有兩種：酶合成法和酶降解法。

酶合成法主要通過選擇特定的酶作為催化劑，將半乳糖醛酸糖單元以α-1，4-糖苷鍵連接，最終形成果膠寡糖。由于酶合成法所需的糖苷酶價格較高，制備過程繁瑣、產率低，因此該方法不適用工業(yè)上大批量的生產。

酶降解法主要利用果膠酶的作用將果膠降解為果膠寡糖。該方法具有反應條件溫和、寡糖分離純化的工藝較簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于工業(yè)化生產中。

2.2.1 果膠酶的種類

降解果膠的果膠酶主要分類見表1。

表1 果膠酶的種類Table 1 Pectinase species

2.2.2 果膠酶的改造研究

目前果膠酶的改造主要有3種方法，高產果膠酶菌株的篩選、誘變育種、基因工程。

2.2.2.1 高產果膠酶的菌株

研究表明果膠酶主要來源于細菌、真菌及放線菌。楊逸飛等[32]從來源于海南的土壤樣品中篩選出一株枯草芽孢桿菌，所產的果膠酶具有較好的耐堿性和熱穩(wěn)定性。尹樂斌等[33]從湖南省武岡市臍橙果園土樣中分離得一株尖孢鐮刀菌BM201，所產果膠酶酶活高達421 U/L。張耀廣等[34]從18份復烤煙草中分離出38株可降解果膠的細菌和9株可降解果膠的真菌，結果表明其中有5株細菌具有較強的果膠降解能力。

2.2.2.2 誘變育種

誘變育種具有操作簡單、成本低的優(yōu)點，因此被廣泛用于果膠酶的改造。Hadj-Taieb等[35]使用亞硝酸誘變青霉菌后得到一株突變型菌株CT1，該株菌的酶活顯著高于其他野生菌株。葛新宇[36]使用脈沖強光誘變黑曲霉，顯著提高果膠酶的酶活并改變菌株產酶的性質。黃丹梅等[37]通過對黑曲霉進行紫外光照誘變，得到了高產果膠酶的黑曲霉菌株。此外，氮離子注入誘變技術也是目前的研究熱點之一。陳麗娟等[38]對產復合酶黑曲霉菌注入氮離子能量，進行誘變處理后得到變異菌株，結果表明該變異菌株的果膠酶、纖維素酶和酸性蛋白酶的酶活力顯著提高。誘變種類及優(yōu)缺點見表2。

表2 誘變種類及優(yōu)缺點Table 2 Types and relative merits of mutagenesis

2.2.2.3 基因工程技術

基因工程技術可以在分子水平上改變產物酶學性質。韓萌萌等[39]從黑曲霉中克隆出果膠甲酯酶基因pmeA，構建出能分泌表達果膠甲酯酶的純合重組菌株TH-2，再敲除TH-2中能分泌α-淀粉酶的asaA基因，最后得到溫度和pH值作用范圍均較寬的高產果膠甲酯酶的黑曲霉工程菌。陳恩發(fā)等[40]通過PCR技術克隆果膠鹽裂解酶基因，構建出原核表達載體，結果發(fā)現魔芋軟腐中的兩個致病基因pelD和pelE經誘導后酶活均明顯升高。

綜上所述，基因工程技術克服了傳統(tǒng)育種的盲目性，不僅能提高菌株的產酶能力，還能改變酶的性質。

3 展望

功能性低聚糖的研究一直是近年來的熱點，其多種功能活性在醫(yī)藥、農業(yè)、食品等方面都具有廣闊的應用前景。褐藻寡糖作為典型海洋寡糖，對其功能活性的深入研究可以為開發(fā)其他功能性海洋寡糖有良好的借鑒作用。目前的研究結果表明，生物法是褐藻寡糖和果膠寡糖相對高效、安全、成本較低的制備方法。

就目前的技術手段、研究熱點而言，突破功能性低聚糖高效制備的關鍵性難題仍需在以下幾點做好攻關：一是融合跨學科的科學方法。結合人工智能技術，深入挖掘多種方法研究功能性低聚糖的作用，并開發(fā)優(yōu)化低聚糖制備的新方法、新設備；二是繼續(xù)加強基礎研究的力度。利用多組學技術手段探明菌株產酶的分子機制和物質基礎，設計新思路構建高效產酶菌株的篩選模型和方法，最終實現低聚糖研究的重要突破。