高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)腎移植患者泊沙康唑血藥濃度*

林冠麗 ，楊佳彬 ，尹 威 ，張其愛(ài) ，曾彩芳 △

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510210； 2. 廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511495）

泊沙康唑?qū)俚?代三唑類抗真菌藥物，相較于三唑類與棘白菌素等抗菌藥物，具有抗菌效果好、抗菌譜廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，其血藥濃度與臨床療效相關(guān)［3］，是預(yù)防和治療全身性真菌病的一線藥物［4］。但口服三唑類藥物泊沙康唑的生物利用度會(huì)受到食物攝入量的影響，同時(shí)個(gè)體間的藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異顯著［5］。目前，泊沙康唑主要?jiǎng)┬蜑榭诜鞈乙海倚枧c食物（最好是高脂肪餐）同服才能提高生物利用度。腎移植患者?？诜瓷晨颠蛞苑乐握婢腥荆?］，但腎移植術(shù)后并發(fā)侵襲性真菌感染導(dǎo)致移植腎失功和受體移植帶功的死亡率達(dá)40%［7］。其主要原因?yàn)榭诜瓷晨颠虻膫€(gè)體差異性，以及移植腎加劇了其個(gè)體差異性［8］，導(dǎo)致患者用藥后血藥濃度未達(dá)到有效治療窗或預(yù)防濃度感染致死。此外，腎移植術(shù)后患者需服用免疫抑制劑，而泊沙康唑會(huì)影響其血藥濃度。血藥濃度超出治療窗可能導(dǎo)致肝、腎功能損傷，神經(jīng)毒性和胃腸道反應(yīng)，甚至可能影響移植腎的恢復(fù)。因此，需實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)腎移植患者體內(nèi)泊沙康唑的血藥濃度，并通過(guò)個(gè)性化給藥防治真菌感染，降低死亡率。目前，國(guó)內(nèi)外定量檢測(cè)泊沙康唑的方法有高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC - MS/ MS）法［9-11］、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - MS/ MS）法［12-13］、還原氧化石墨烯（rGO）和熒光標(biāo)記的適配體方法［14］。但方法專屬性差，分析時(shí)間長(zhǎng)，缺少腎移植患者臨床實(shí)際用藥指導(dǎo)的相關(guān)研究。為此，本研究中建立了精準(zhǔn)、快速、高效檢測(cè)腎移植患者體內(nèi)泊沙康唑血藥濃度的HPLC-MS/MS法，并對(duì)7例腎移植患者進(jìn)行了臨床用藥指導(dǎo)，制訂了個(gè)體化給藥方案，及時(shí)調(diào)整給藥劑量，縮短了病程，節(jié)約了治療成本，臨床療效更好?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與研究對(duì)象

1.1 儀器

1200-G6410B型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫科技<中國(guó)>有限公司）；CPA225D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

泊沙康唑口服混懸液（Patheon Inc.，Whitby Operations，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)為H20181110，規(guī)格為每瓶40 mg∶1 mL）；泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為3 - JLW - 13 - 1），泊沙康唑-d（4內(nèi)標(biāo)，批號(hào)為12-MRS-161-1），純度均為98%，均購(gòu)自美國(guó)TRC 公司；乙腈、甲醇（德國(guó)默克股份兩合公司）；乙酸銨（廣州化學(xué)試劑廠，純度為98%）；試驗(yàn)用水為蒸餾水；空白血漿由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供。

1.3 研究對(duì)象

選取醫(yī)院移植科2020 年12 月至2021 年4 月收治的確診或高度懷疑侵襲性真菌感染、有侵襲性真菌感染高危因素的7 例腎移植術(shù)后服用泊沙康唑口服混懸液的患者，其中預(yù)防用藥4例、治療用藥3例，共完成13例次血樣檢測(cè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 - 10 mmol / L 乙酸銨（85∶15，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

正離子，電噴霧電離（ESI）源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定量掃描。離子源：ESI，電壓為4 000 V，溫度為300 ℃；霧化氣流速：6 L/min；碰撞氣壓力：40 psi。其他參數(shù)：質(zhì)荷比（m/z）泊沙康唑離子對(duì)為701.5 →683.6，內(nèi)標(biāo)離子對(duì)為705.5 → 687.6；碎裂電壓為235 eV；碰撞能量為37 eV；駐留時(shí)間為200 ms。

2.2 樣本采集與處理

采用蛋白沉淀法處理血清樣本，患者首次口服泊沙康唑混懸液后第5天，于下一劑給藥前30 min采集血樣5 mL，置無(wú)抗凝劑的采血管中，精密吸取100 μL，置2 mL 離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋混勻，加乙腈1 mL，渦旋振蕩1 min，離心（溫度為21 ℃，轉(zhuǎn)速為15 000 r/min）5 min，吸取上清液200 μL，即得供試品。在空白血清樣本處理前加入適量待測(cè)物，其他操作與供試品一致，即得加標(biāo)樣品。取空白血清，按供試品處理方法處理，即得陰性樣品。

2.3 溶液制備

取泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)品2.264 mg，精密稱定，用少量95%甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用95%甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為452.8 μg/ mL 的泊沙康唑貯備液。4 ℃下保存，備用。取內(nèi)標(biāo)0.50 mg，精密稱定，加適量95%甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，用95%甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)母液，用50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為2.00 μg/ mL 的內(nèi)標(biāo)貯備液。4 ℃下保存，備用。

根據(jù)不同工作要求，泊沙康唑貯備液用50%甲醇稀釋，配制成所需質(zhì)量濃度。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取6 例患者的空白血清和用藥后的血漿（加入內(nèi)標(biāo)溶液），按2.2 項(xiàng)下方法處理，得陰性樣品和供試品，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1。供試品色譜圖中，泊沙康唑和內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形良好，保留時(shí)間分別為3.618 min 和3.603 min；陰性樣品色譜圖中，內(nèi)標(biāo)色譜峰峰形良好，泊沙康唑無(wú)信號(hào)響應(yīng)。結(jié)果表明，方法專屬性良好，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的測(cè)定不受樣品內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 Chromatograms of HPLC-MS/MS

線性關(guān)系考察：取空白血清，按2.2項(xiàng)下方法處理，精密加入2.3項(xiàng)下泊沙康唑貯備液適量，配制成泊沙康唑質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以分析物泊沙康唑與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)、泊沙康唑質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以1/（X2）為權(quán)重系數(shù)，繪制泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 9.192 7X+0.052 1（R2=0.990 2，n= 8）。結(jié)果表明，泊沙康唑的血藥濃度在0.05～10.00 μg/mL 范圍內(nèi)與分析物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值的線性關(guān)系良好，且標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的質(zhì)量濃度偏差均在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，符合要求。

定量下限確定：同時(shí)滿足準(zhǔn)確度和精密度要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度為定量下限，即0.05 μg/mL。

殘留檢測(cè)：一般情況下，檢測(cè)高質(zhì)量濃度后會(huì)存在一定殘留效應(yīng)，故檢測(cè)定量上限（10.00 μg/ mL）樣本后，再檢測(cè)3個(gè)空白血清樣本，以評(píng)價(jià)殘留效應(yīng)。結(jié)果均未檢出殘留泊沙康唑，即殘留未超過(guò)定量下限的20%［15］，符合要求。

批內(nèi)、批間精密度試驗(yàn)［15］：在空白血清樣本中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的泊沙康唑及內(nèi)標(biāo)，分別制成定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度（0.05，0.15，1.50，8.00 μg/mL）各6 個(gè)參比樣品，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。結(jié)果批內(nèi)、批間精密度試驗(yàn)結(jié)果的均值均在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的± 15%范圍內(nèi)，變異系數(shù)（CV）分別為7.16%，3.46%，6.03%，2.67% 和 4.00%，3.28%，4.41%，2.78%（n=18）。

基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定：收集6 例患者的空白血樣，處理后得到空白血清基質(zhì)，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）的質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積；同質(zhì)量濃度的質(zhì)控溶液不經(jīng)過(guò)處理直接進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果質(zhì)控溶液基質(zhì)效應(yīng)的RSD分別為4.92%，7.75%，2.34%（n=6）；內(nèi)標(biāo)溶液基質(zhì)效應(yīng)的RSD分別為7.25%，4.94%，7.37%（n=6）。表明基質(zhì)干擾較小，符合要求［15］。

提取回收試驗(yàn)：分別配制低、中、高質(zhì)量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）的質(zhì)控血清樣本，平行6 份；空白血清樣本處理后加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的泊沙康唑及內(nèi)標(biāo)，制成低、中、高相應(yīng)質(zhì)量濃度的參比樣品，平行6份，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血清樣本的平均提取回收率分別為83.08%，87.47%，82.75%，RSD分別為2.67%，3.09%，1.99%（n= 6），表明提取回收率良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：1）冷藏及室溫條件穩(wěn)定性。取提取回收試驗(yàn)項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）質(zhì)控血清樣本，分別在冷藏（4 ℃）和室溫（10～30 ℃）條件下放置24 h和192 h進(jìn)行預(yù)處理，定量分析測(cè)得實(shí)際濃度，與相應(yīng)標(biāo)示濃度對(duì)比。結(jié)果見(jiàn)表1，RSD均在±15%范圍內(nèi)［15］，符合要求。2）凍融穩(wěn)定性。泊沙康唑血樣低、中、高質(zhì)量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）質(zhì)控工作液于冷凍（-12 ℃）條件下保存24 h，取出，置室溫融化后進(jìn)行預(yù)處理；或融化后再放回冷凍（-12 ℃）條件保存，反復(fù)3次預(yù)處理，進(jìn)行定量分析，測(cè)得實(shí)際濃度，與相應(yīng)標(biāo)示濃度對(duì)比。結(jié)果見(jiàn)表1，RSD均在 ± 15%范圍內(nèi)［15］，符合要求。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD（%）Tab.1 RSDs of the stability test（%）

2.5 臨床應(yīng)用

血藥濃度分布：7例腎移植術(shù)后患者正常給藥后，采用HPLC-MS/MS法測(cè)定泊沙康唑的血藥濃度。結(jié)果顯示，所有樣本泊沙康唑血藥濃度均在0.13～1.27 μg/mL范圍內(nèi)，4 例預(yù)防用藥患者的平均血藥谷濃度為0.37 μg/mL，均未達(dá)預(yù)防有效濃度（>0.70 μg/mL）；3 例治療用藥患者的平均血藥谷濃度為0.71 μg/ mL，僅1 例達(dá)到治療有效濃度（>1.00 μg/mL）［16］。泊沙康唑的吸收有個(gè)體差異，且易受多種因素影響，本研究中多數(shù)腎移植患者的血藥濃度未達(dá)到有效濃度，故泊沙康唑的血藥濃度監(jiān)測(cè)很有必要。

指導(dǎo)用藥：針對(duì)上述問(wèn)題，迅速調(diào)整給藥劑量或次數(shù)，制訂個(gè)性化用藥方案，多數(shù)腎移植患者用藥后均達(dá)到有效血藥濃度。其中，1 例病情嚴(yán)重患者經(jīng)個(gè)性化指導(dǎo)后，相較于傳統(tǒng)給藥方法，病程縮短。其臨床資料：男，52歲，體質(zhì)量52 kg，“慢性腎衰竭”診斷入院，入院后行腎移植手術(shù)，術(shù)后并發(fā)肺炎，痰培養(yǎng)白色念珠菌（+），給予“泊沙康唑混懸液10 mL，po q12 h”治療，用藥第5天，于下一劑給藥前30 min 采血測(cè)得泊沙康唑血藥濃度為0.13 μg/mL，未達(dá)到有效治療濃度。次日，詢問(wèn)患者用藥情況，得知服藥量不足10 mL，且為餐前服藥。隨即對(duì)患者進(jìn)行用藥教育，量裝藥液前需充分振搖藥瓶，混勻后立即倒入量匙，量匙量裝藥液時(shí)要裝滿，每次需服用 10 mL（2 勺），每日 2 次，隨餐或餐后 20 min 內(nèi)服用；并向患者說(shuō)明隨餐或餐后服用有利于增加泊沙康唑的吸收，提高血藥濃度，達(dá)到有效治療濃度。宣教后，患者用藥依從性佳，5 d 后再次測(cè)得泊沙康唑血藥濃度為0.52 μg/mL，未達(dá)有效治療窗（>1.00 μg/mL）。隨即替換為“泊沙康唑混懸液10 mL，po q 8 h”，達(dá)穩(wěn)態(tài)后測(cè)得血藥濃度為1.27 μg/mL，繼續(xù)治療，效果較佳。胸片示肺部炎癥基本消失，轉(zhuǎn)歸，出院回家休養(yǎng)。

3 討論

本研究中對(duì)監(jiān)測(cè)泊沙康唑血藥濃度的HPLC-MS/MS法進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。結(jié)果表明，方法基質(zhì)效應(yīng)干擾低；血清中泊沙康唑的濃度在0.05～10.00 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2=0.990 2，n=8），且定量限低，準(zhǔn)確度和精密度均良好；方法耐用性好，殘留效應(yīng)小，提取回收率高。相較于外標(biāo)法，以同位素泊沙康唑-d4為內(nèi)標(biāo)，能降低質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中信號(hào)波動(dòng)帶來(lái)的影響。且樣品前處理方便，具有快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，有利于腎移植患者泊沙康唑血藥濃度的快速分析。

由本研究結(jié)果可知，采用HPLC - MS/ MS 法檢測(cè)患者的血藥濃度，可快速、準(zhǔn)確地掌握患者用藥后的實(shí)際情況，并及時(shí)調(diào)整給藥方案，使患者在調(diào)整用藥劑量后均達(dá)治療有效濃度，較好地控制病情。若未對(duì)泊沙康唑血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，無(wú)法確定是否在有效治療窗內(nèi)發(fā)揮最佳藥效，可能延誤病情，從而累及移植腎甚至危及生命安全；且泊沙康唑口服混懸液價(jià)格高昂，若未能實(shí)現(xiàn)應(yīng)有的治療效果，無(wú)法發(fā)揮其藥物經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故需臨床藥師及時(shí)、快速掌握患者服用泊沙康唑后的血藥濃度，進(jìn)行個(gè)性化指導(dǎo)用藥，以提高療效，節(jié)約成本。

本研究具有以下局限性：1）受時(shí)間限制納入樣本量較少，未能很好地統(tǒng)計(jì)泊沙康唑的療效及相關(guān)不良反應(yīng)；2）腎移植患者的生理變化和所服用的其他治療藥物可能影響泊沙康唑的血藥濃度。對(duì)于其他因素導(dǎo)致的泊沙康唑血藥濃度的變化需結(jié)合臨床具體分析，后期會(huì)收集更多的病例數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。