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    MaReCs技術在胚胎植入前染色體結構異常遺傳學檢測周期中的應用研究*

    2022-12-20 10:14:46袁振亞黃曉潔
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2022年23期
    關鍵詞:整倍體易位囊胚

    袁振亞,袁 牧,黃曉潔

    (徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心,江蘇 徐州 221009)

    平衡易位是一種較常見的染色體結構畸變,在一般人群中發(fā)生率約為0.2%[1-3]。羅伯遜易位又稱為羅氏易位,是平衡易位的一種特殊形式。平衡易位患者產(chǎn)生異常配子的概率很高,可能導致不孕、胚胎停止發(fā)育、反復妊娠丟失、出生缺陷等一系列生殖或遺傳問題,給患者家庭和社會帶來痛苦和負擔[4]。胚胎植入前染色體結構異常遺傳學檢測(PGT-SR)技術可篩選出整倍體胚胎進行移植,有效解決了平衡易位患者的生育困擾。然而,常規(guī)PGT-SR無法識別胚胎是否攜帶易位染色體,因而無法阻斷染色體易位在家族中的傳遞[5]。等位基因映射識別胚胎易位染色體攜帶狀態(tài)(MaReCs)技術,可精準鑒別平衡易位患者PGT-SR周期獲得的整倍體胚胎是否攜帶易位染色體,徹底阻斷染色體易位向后代傳遞[6-7]。本研究探討了MaReCs檢測在PGT-SR周期中應用的臨床價值。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 選取2019年1月至2021年9月本中心平衡易位和羅氏易位患者49例,共有49個PGT-SR周期,其中羅氏易位17個周期,納入羅氏易位組(RobT組,17例);平衡易位32個周期,納入平衡易位組(RecT組,32例)。將RecT組中成功進行MaReCs檢測和成功構建單體型但因沒有整倍體胚胎而無法進行MaReCs檢測的患者進一步分為RecT_T亞組和RecT_F亞組。納入標準:(1)患者及配偶有一方明確診斷為平衡易位,且另一方染色體核型無明顯異常(320~400條帶,G顯色);(2)患者及配偶已簽署相關知情同意書,已在本中心接受PGT-SR技術治療;(3)同意接受采用MaReCs檢測識別整倍體胚胎是否攜帶易位染色體。排除標準:(1)任何一方患有嚴重精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾??;(2)患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育的疾病;(3)任何一方具有吸毒等嚴重不良嗜好;(4)任何一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期;(5)其他不適于進行PGT-SR或MaReCs檢測的情況。所有患者在接受PGT-SR和MaReCs檢測前均接受了詳細、充分的遺傳咨詢。本研究獲得了院生殖醫(yī)學倫理委員會批準。2組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

    表1 2組女性患者一般資料比較

    組別nP(ng/mL)LH(mIU/mL)AMH(ng/mL)AFC(個)RobT組170.41±0.174.73±1.794.99±4.3515.82±5.75RecT組320.55±0.494.33±2.473.91±2.6115.09±6.04

    1.2儀器與試劑 體外受精:工作站(PICB-130,上海品濟公司);倒置顯微鏡(Stemi 508,德國ZEISS公司);顯微操作系統(tǒng)(MTK-1,日本NARISHIGE公司);顯微注射針(K-MPIP-3330,美國COOK Medical公司);持卵針(K-HPIP-1030,美國COOK Medical公司)。胚胎培養(yǎng):胚胎培養(yǎng)液(G-TL,瑞典Vitrolife公司);時差培養(yǎng)系統(tǒng)(EmbryoScope+,瑞典Vitrolife公司)。囊胚活檢:活檢針(SBB-20Z-30,美國Sunlight Meidical公司);持卵針(型號:K-HPIP-1030,美國COOK Medical公司)。囊胚玻璃化冷凍與解凍:玻璃化冷凍液(VT101,日本Kitazato公司);玻璃化解凍液(VT102,日本Kitazato公司)。MaReCs檢測:活檢樣本保存液(型號:XK-043,美國Illumina公司);基因測序通用樣本處理試劑盒(XK-028-24,美國Illumina公司);基因測序文庫試劑盒(XK-038-48,美國Illumina公司);測序反應通用試劑盒(XK-034,美國Illumina公司);SNP位點引物試劑盒(KT10080,Illumina,美國);Miseq測序儀(美國Illumina公司)。

    1.3方法

    1.3.1控制性超促排卵 采用長方案或拮抗劑方案對患者進行控制性超促排卵,最大卵泡直徑18 mm及以上或有2個卵泡直徑以上達到16 mm即為扳機日。在B超引導下行陰道穿刺取卵。

    1.3.2體外受精與胚胎培養(yǎng) 對患者均行卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)術完成授精,使用G-TL培養(yǎng)液和時差培養(yǎng)系統(tǒng)進行胚胎培養(yǎng)和形態(tài)學觀察。

    1.3.3囊胚活檢 在培養(yǎng)至5~6 d后(受精日為第0天)發(fā)育成囊胚,對囊胚進行形態(tài)學評級(參照Gardner囊胚分級標準),對評級為4CB或4BC以上囊胚進行活檢。囊胚活檢采用機械法和激光法結合的方式,活檢3~10個囊胚外滋養(yǎng)層細胞,不損傷囊胚內的細胞團,活檢細胞樣本嚴格按編號裝入含有細胞裂解液的收集管中用于PGT-SR檢測?;顧z后的囊胚嚴格按編號進行玻璃化冷凍。

    1.3.4識別囊胚易位攜帶狀態(tài) 基于下一代測序(NGS)的PGT-SR檢測可幫助篩選出整倍體囊胚(分辨率4 Mb)。采用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術,對活檢樣本進行單細胞全基因組擴增,構建文庫后上機測序,通過MaReCs檢測,根據(jù)NGS信息尋找易位染色體斷裂點上下游單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點,構建易位染色體的SNP單倍體分型特征。將胚胎染色體SNP單體型和易位染色體SNP單體型進行比較,可鑒別胚胎是否攜帶親本的易位染色體。

    1.3.5移植與隨訪 PGT-SR與MaReCs檢測結果明確有可移植囊胚后,做好人工周期的內膜準備,將不攜帶易位染色體的整倍體囊胚解凍復蘇,完成移植。如果本周期僅有攜帶的囊胚,患者需要接受充分的遺傳咨詢后再決定是否進行移植。所有周期均采用單囊胚移植。移植后14 d檢測血人絨毛膜促性腺激素(>20 mIU/mL)、移植后28 d B超下可見孕囊即為臨床妊娠。妊娠16~20周進行羊水穿刺術,分析胎兒的染色體整倍性及核型,判斷產(chǎn)前診斷結果與PGT-SR和MaReCs檢測結果是否一致。

    1.3.6觀察指標 D0獲卵總數(shù)、第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)卵數(shù)、MⅡ卵率(MⅡ卵數(shù)/D0獲卵總數(shù)×100%)、雙原核受精卵(2PN)數(shù)、2PN受精率(2PN數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%)、2PN卵裂數(shù)、2PN卵裂率(2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)×100%)、D3優(yōu)質胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)、囊胚形成率(囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%)、可活檢囊胚形成數(shù)、可活檢囊胚形成率(可活檢囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%)、整倍體率(整倍體數(shù)/成功檢測囊胚數(shù)×100%)、非整倍體率(非整倍體數(shù)/成功檢測囊胚數(shù)×100%)、嵌合體率(嵌合體數(shù)/成功檢測囊胚數(shù)×100%)、胚胎易位染色體攜帶率(攜帶易位胚胎數(shù)/整倍體胚胎數(shù)×100%)、SNP單體型構建成功率(SNP單體型構建成功周期數(shù)/要求進行MaReCs周期數(shù)×100%)。

    2 結 果

    2.1RobT組與RecT組胚胎培養(yǎng)情況比較 2組均進行了ICSI周期和全囊胚培養(yǎng)。2組獲卵總數(shù)、MⅡ卵數(shù)、MⅡ卵率、2PN數(shù)、2PN率、2PN卵裂數(shù)、2PN卵裂率、D3優(yōu)質胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)、囊胚形成率、可活檢囊胚形成數(shù)、可活檢囊胚形成率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

    表2 RobT組與RecT組胚胎培養(yǎng)情況比較

    組別n2PN卵裂率(%)D3優(yōu)質胚胎數(shù)(枚)形成囊胚數(shù)(枚)囊胚形成率(%)可活檢囊胚形成數(shù)(枚)可活檢囊胚形成率(%)RobT組17100.00±0.005.59±5.006.12±4.7376.15±16.965.00±4.4660.97±25.63RecT組3299.65±1.445.25±3.645.03±2.9767.52±24.493.75±2.5450.95±24.60

    2.2RobT組與RecT組PGT-SR與MaReCs檢測結果比較 RobT組中,12例要求進行MaReCs檢測,其中11例成功進行了MaReCs檢測。RecT組中,23例要求進行MaReCs檢測,其中12例成功進行了MaReCs檢測。見表3。

    表3 RobT組與RecT組PGT-SR與MaReCs檢測結果比較

    組別n要求MaReCs檢測(n)MaReCs檢測成功檢測(n)整倍體率[%(n/n)]胚胎易位染色體攜帶率[%(n/n)]SNP單體型構建成功率[%(n/n)]RobT組17121171.21(47/66)53.19(25/47)91.67(11/12)RecT組32231234.38(22/64)45.45(10/22)95.65(22/23)

    2.3RecT_T亞組與RecT_F亞組相關指標比較 在RecT組中,成功進行MaReCs檢測的患者(12例)和成功構建單體型但因沒有整倍體胚胎而無法進行MaReCs檢測的患者(10例)共22例,進一步分為RecT_T亞組(12例)和RecT_F亞組(10例)。2亞組年齡、AMH、AFC及D0獲卵總數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但形成囊胚數(shù)及活檢囊胚數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

    表4 RecT_T亞組與RecT_F亞組相關指標比較

    2.4RobT組與RecT組移植結局分析 RobT組中,2例僅有攜帶易位染色體囊胚的患者接受遺傳咨詢后決定進行下一周期。9例MaReCs周期患者均移植了不攜帶親本易位染色體的整倍體囊胚并成功受孕。羊水穿刺樣本染色體核型分析、染色體芯片檢測結果與PGT-SR和MaReCs檢測結果一致。其中,8例順利分娩,1例妊娠。RecT組中,2例僅有攜帶易位染色體囊胚的患者接受遺傳咨詢后決定進行下一周期。10例MaReCs周期患者均移植了不攜帶親本易位染色體的整倍體囊胚并成功受孕。羊水穿刺樣本染色體核型分析、染色體芯片檢測結果與PGT-SR和MaReCs檢測結果一致。其中,9例順利分娩,1例流產(chǎn)。

    3 討 論

    染色體平衡易位可產(chǎn)生染色體不平衡胚胎,導致不孕、胚胎停止發(fā)育、反復妊娠丟失、出生缺陷患兒等。為使平衡易位患者的后代不再遭受染色體易位導致的生育壓力,徹底阻斷易位染色體在家族中的傳遞,則須實現(xiàn)在孕前對胚胎同時進行染色體整倍性篩查及易位攜帶狀態(tài)的檢測。目前,廣泛應用的基因芯片技術及二代測序技術可檢測出胚胎染色體的拷貝數(shù)變異情況,卻無法識別其易位攜帶狀態(tài)。熒光原位雜交技術可以診斷復雜的染色體易位,但對單個細胞檢測效果欠佳[8-11]。染色體顯微切割技術也可明確易位斷裂位點信息,結合二代測序技術識別胚胎染色體易位攜帶狀態(tài),但該技術操作復雜,需要高度專業(yè)的設備和熟練的操作技能,不適于在臨床上廣泛應用[12]。

    構建易位染色體SNP單體型是成功識別胚胎易位攜帶狀態(tài)的關鍵。由于羅氏易位和平衡易位患者產(chǎn)生平衡配子的機會有差異,患者夫婦通過1次促排卵周期能夠獲得整倍體胚胎、成功完成胚胎易位攜帶狀態(tài)識別的概率也存在差異。前期研究發(fā)現(xiàn),約有50%的平衡易位與羅氏易位患者在首個PGT-SR周期可成功進行MaReCs檢測[13]。本研究結果顯示,12例要求MaReCs檢測的羅氏易位患者中,11例獲得整倍體胚胎并成功完成MaReCs檢測(完成率為91.67%);23例要求MaReCs檢測的平衡易位患者中,12例獲得整倍體胚胎并成功完成MaReCs檢測(完成率為52.17%)。本研究結果顯示,采取靈活、高效的臨床策略,結合MaReCs技術,羅氏易位與平衡易位患者在首個促排卵周期分別有91.67%和95.65%的單體型構建成功率[14-16]。如果本周期或下一周期獲得整倍體胚胎,即可進行MaReCs檢測,識別胚胎的易位染色體攜帶狀態(tài)。首次促排卵沒有成功構建單體型的患者往往有2個特征:一是活檢胚胎數(shù)少;二是無法通過親本獲取用于構建單體型的NGS信息。對這類患者,應繼續(xù)進行促排卵周期,獲得更多與易位異常相關的信息,幫助構建易位染色體SNP單體型,完成MaReCs檢測。

    綜上所述,MaReCs檢測是一種高效、靈活的識別胚胎易位染色體攜帶狀態(tài)的方法,可徹底阻斷易位染色體在家族中的傳遞。平衡易位患者往往比羅氏易位患者擁有更強烈的區(qū)分攜帶的意愿,不希望子代繼續(xù)面臨易位帶來的生育風險。MaReCs檢測是一項靈活、高效區(qū)分胚胎易位攜帶狀態(tài)的技術,在保證醫(yī)療安全的情況下,應充分考慮患者的實際情況,采用靈活高效的臨床策略,運用MaReCs檢測阻斷染色體易位向后代傳遞,降低生育風險,減輕人類遺傳負荷,提高人口素質。

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