川芎嗪對椎間盤退變大鼠模型髓核細胞的保護作用研究*

許 洋，李金海，謝昊真，楊成綱

(江西省瑞金市人民醫(yī)院骨科，江西 贛州 342500)

髓核細胞(NP)位于椎間盤的中心，在椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1]。目前的觀點認為，機械負荷會通過NP的被動擠壓導致椎間盤退變，隨后在長期負荷下出現(xiàn)成纖維細胞樣改變及程序性凋亡，并進一步導致椎間盤的可塑性破壞[2-3]。值得注意的是，隨著NP凋亡的發(fā)生發(fā)展，來自NP的生化因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)，被發(fā)現(xiàn)是誘發(fā)盤源性疼痛的主要病理生理機制[4]。目前在臨床實踐中，針對椎間盤退變的治療手段十分有限，主要是單純癥狀緩解的抑制疼痛治療[5-6]。因此，理想的治療應選擇能夠在緩解NP介導疼痛生物學機制的同時，還能抑制NP凋亡的發(fā)生，延緩椎間盤退變進展。

隨著老齡化社會的到來，脊柱退變治療無疑是社會醫(yī)療的重大課題，開發(fā)經(jīng)濟有效的脊柱退變治療方法迫在眉睫，而中國傳統(tǒng)中草藥無疑有著巨大的藥用潛力。川芎嗪作為一種川芎根莖提取的生物堿，已廣泛用于緩解疼痛的臨床治療[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪在調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎性反應方面起著重要作用[8]。本研究通過手術(shù)構(gòu)建椎間盤退變大鼠模型，探索了川芎嗪對椎間盤NP細胞凋亡和炎癥疼痛反應的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取成年SD大鼠54只，體重240～260 g，隨機分為假手術(shù)組、對照組和川芎嗪組，每組18只。大鼠由華南理工大學實驗動物中心提供。

1.2儀器與試劑 川芎嗪(貨號:95162，100 mg)分析純、脂多糖(貨號:L3012，10 mg)購自德國SIGMA公司；兔源一抗Beclin、LC3B、TNF-α和IL-1，鼠源一抗GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自英國Abcam公司；Hoechst33258染色試劑盒(貨號:C0003)購自英國Abcam公司。垂直電泳儀購自美國Bio-RAD公司；microplate reader酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；日立7180全自動生化儀購自日本日立公司；蔡司透射電子顯微鏡購自德國Carl Zeiss AG公司；共聚焦FV1000顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1椎間盤退變大鼠動物模型建立 采用自體NP神經(jīng)根病模型，主要操作步驟如下，先行尾椎椎間盤提取，即直接切開每只大鼠尾部椎間盤取3～4個髓核，約10 mg。隨后下腰部皮膚準備后，在L4～S1水平做切口，切除筋膜和多裂肌，暴露L4、L5椎體，左側(cè)L4～L5半月形切除椎板暴露左側(cè)L5神經(jīng)根和背根神經(jīng)節(jié)。注意避免神經(jīng)組織損傷。在確定環(huán)狀纖維后，使用注射器挑破纖維環(huán)，同時將從大鼠自體尾部獲取的自體NP置于對照組和川芎嗪組背根神經(jīng)節(jié)及纖維環(huán)破損處，以模擬椎間盤退變凸出病理過程(圖1)。在假手術(shù)組中，僅暴露L5神經(jīng)根和背根神經(jīng)節(jié)，而不進行其他神經(jīng)組織處理。川芎嗪組以100 mg/kg劑量每天行腹腔注射，假手術(shù)組和對照組每天腹腔注射生理鹽水2 mL。每組分別在術(shù)后7、14 d時取L4～L5椎間盤內(nèi)髓核組織。

圖1 椎間盤退變模型建立示意圖

1.3.2免疫組化 各組樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用3%多聚甲醛固定，再次用PBS漂洗3次，每次5 min。然后，將樣品與一抗在封閉液中稀釋后孵育。最后將染色樣品在共聚焦FV1000顯微鏡下觀察并攝片。

1.3.3Western blot檢測 各組樣品經(jīng)PBS清洗后按蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，100 ℃變性5 min。然后等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。經(jīng)5%的牛血清清蛋白封閉1 h后加入相應的一抗，4 ℃過夜孵育。第2天加入HRP標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液，以GAPDH為內(nèi)參于凝膠成像儀進行曝光拍照及條帶灰度分析。

1.3.4自噬小體顯微鏡觀察 提取組織NP細胞后將其在PBS中用3%戊二醛固定過夜，再用1%四氧化二釤在室溫下固定1 h。在分級乙醇系列中脫水后，將樣品包埋于環(huán)氧樹脂黏合劑中，切成超微切片，室溫下甲苯胺藍染色1 min以定位細胞。最后將其制作成70 nm的切片并置于透射電子顯微鏡下攝片觀察。

1.3.5細胞凋亡檢測 各組樣品用PBS洗滌2次，用3%多聚甲醛固定后，按照Hoechst33258染色試劑盒說明書對待測組織依次進行固定、染色和封片。熒光顯微鏡下(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)觀察細胞，并統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)目。

1.3.6觀察指標 觀察指標主要包括行為學和生物學指標。行為學指標使用馮弗雷纖維刺激左足底測試術(shù)畢及術(shù)后7、14、21 d時痛覺反應。生物學指標主要包括在術(shù)后7、14 d時炎癥因子TNF-α和IL-1陽性表達情況，以及自噬標志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達水平。最后在術(shù)后14 d時觀察自噬小體形成情況，同時檢測NP凋亡水平。

1.4統(tǒng)計學處理 采用STATA13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料兩組間比較采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.13組盤源性疼痛改善情況比較 在假手術(shù)組中，所有大鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的刺激性機械收縮，總體上接近于術(shù)前基線。對照組和川芎嗪組各時間點機械回縮閾值低于假手術(shù)組(P<0.05)。與假手術(shù)組基線值比較，對照組各時間點機械回縮閾值顯著降低，直至第21天，表明疼痛是由暴露的NP誘發(fā)的神經(jīng)根疼痛。川芎嗪組在應用川芎嗪治療后，疼痛情況較對照組獲得明顯改善(P<0.01)。見圖2。

圖2 3組盤源性疼痛改善情況比較

2.23組TNF-α、IL-1陽性表達情況比較 對照組和川芎嗪組術(shù)后7、14 d時TNF-α和IL-1陽性細胞數(shù)量高于假手術(shù)組(P<0.01)。川芎嗪組術(shù)后7、14 d時TNF-α和IL-1陽性細胞數(shù)量低于對照組(P<0.05)。見圖3。川芎嗪改善疼痛的作用可能與抑制炎癥因子TNF-α和IL-1表達水平有關(guān)。

圖3 3組TNF-α、IL-1陽性表達情況比較

2.33組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達水平比較 對照組和川芎嗪組術(shù)后7、14 d時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達水平高于假手術(shù)組(P<0.01)。川芎嗪組術(shù)后7、14 d時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達水平低于對照組(P<0.05)。見圖4、5。川芎嗪組術(shù)后14 d時自噬小體形成數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05)。見圖6、7。

圖4 3組Western blot檢測結(jié)果

圖5 3組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達水平比較

圖6 3組透射電子顯微鏡圖片

圖7 3組自噬小體形成數(shù)量比較

2.43組NP凋亡情況比較 對照組和川芎嗪組術(shù)后14 d時NP凋亡水平高于假手術(shù)組(P<0.01)。川芎嗪組術(shù)后14 d時NP凋亡水平低于對照組(P<0.01)。見圖8、9。

圖8 3組Hoechst33258染色圖

圖9 3組NP凋亡情況比較

3 討 論

脊柱退變所致的各種相關(guān)疾病是世界范圍內(nèi)一個主要的臨床醫(yī)療問題，其中疼痛最常見，而髓核退變導致神經(jīng)壓迫也是45歲以下患者殘疾的最常見原因[9]。目前治療腰椎退變的方法仍然存在諸多不足，其治療策略僅限于抑制疼痛癥狀而對于退變的根本原因缺乏有效手段。因此尋找更為有效的治療策略顯得尤為重要。中醫(yī)藥及天然藥物，作為我國重要的醫(yī)學資源，具有廣泛的生物活性作用。因此，如果能夠利用豐富的中醫(yī)藥資源，從中開發(fā)治療脊柱退變藥物，并明確其治療機制，將具有重要的科學意義和社會價值。川芎是一種傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、止痛等功效[10]，其主要活性成分為川芎嗪[11]。川芎嗪能夠活血化瘀，抑制血小板凝集，擴張小動脈，改善微循環(huán)，幫助抗氧化、拮抗鈣，促進抗纖維化[12-13]。近年來，有研究報道川芎嗪對顱腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)有重要作用，并具有抗癌、抗組織纖維化等有益作用[14]。然而，川芎嗪對脊柱退變是否有明顯的保護作用尚不清楚。

目前觀點普遍認為，椎間盤源性疼痛的發(fā)生與NP退變凋亡過程中的促炎細胞因子水平升高密切相關(guān)[15-16]。細胞因子IL-1和TNF-α在NP退變凋亡過程中過度表達，進而誘導局部無菌性炎性反應導致疼痛[5,15-17]。在臨床實踐中，單次靜脈滴注TNF-α抑制劑(英夫利昔單抗)治療腰椎間盤突出癥引起的坐骨神經(jīng)痛是有效的[18]。有研究經(jīng)椎間孔硬膜外注射依那西普治療24例椎間盤突出所致坐骨神經(jīng)痛，并取得了較好的臨床療效[19]。本研究結(jié)果顯示，川芎嗪能夠有效抑制細胞因子IL-1和TNF-α表達水平并緩解疼痛。提示川芎嗪在盤源性疼痛的臨床治療上有著廣闊前景。

椎間盤組織的退變與椎間盤細胞的程序性死亡，以及由此導致的椎間盤細胞外蛋白多糖和Ⅱ型膠原等細胞外基質(zhì)的代謝平衡失調(diào)密切相關(guān)[20-22]。自噬，也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，參與了許多退變性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，如帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病，以及骨性關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎等[23-25]。既往研究表明，川芎嗪可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導的信號通路，從而降低前列腺癌PC3細胞增殖并促進其凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤效應[26]。然而，自噬在椎間盤退變相關(guān)領(lǐng)域的研究仍較少見。本研究結(jié)果顯示，對照組NP自噬水平出現(xiàn)明顯高表達，并進一步誘導細胞凋亡；而川芎嗪則能夠有效抑制自噬表達，從而避免NP的程序性凋亡。提示川芎嗪能夠作為抑制NP退變，進而治療脊椎退變的有效策略之一。

綜上所述，川芎嗪具有抑制椎間盤退變及治療盤源性疼痛作用，其藥理作用可通過抑制椎間盤退變過程中炎癥細胞因子IL-1和TNF-α表達來抑制疼痛發(fā)生，并進一步通過抑制NP自噬性凋亡的發(fā)生發(fā)展來避免椎間盤退變進展，但其具體信號通路機制仍有待進一步研究。