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    CLDN8在腎嫌色細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義*

    2022-12-20 10:12:30李生華張觀蘭李建棣楊藝洲許靜婕龐秋愉陳思智楊小萱李東明唐玉露黨裔武黃志廣
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2022年23期
    關(guān)鍵詞:異質(zhì)性測序標(biāo)本

    李生華,張觀蘭,李建棣,楊藝洲,3,許靜婕,3,龐秋愉,4,陳思智,3,楊小萱,3,唐 鄧,李東明,唐玉露,黨裔武,陳 罡,黃志廣△

    (1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科,廣西 南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系,廣西 南寧 530021;4.廣西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系,廣西 南寧 530021)

    腎細(xì)胞癌是發(fā)生在腎小管上皮的惡性腫瘤,主要分為腎透明細(xì)胞癌和腎非透明細(xì)胞癌。腎非透明細(xì)胞癌中腎嫌色細(xì)胞癌(chRCC)在1985年由THOENES和COLLS等首先報道,約占腎臟腫瘤的5%[1]。chRCC好發(fā)于50~60歲中年人群,多為體檢偶然發(fā)現(xiàn),病理活檢仍為目前臨床確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著生活水平和醫(yī)療技術(shù)的提高,相較其他常見亞型的腎臟腫瘤,chRCC發(fā)病率并不高,但患者數(shù)量不少。有研究顯示,chRCC具有惡性潛能,約6.2%的腫瘤可發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。因此,近年來chRCC逐漸受到關(guān)注和重視。CLDN8(Claudin8)基因位于人類染色體21q22.11上,是一種參與構(gòu)成緊密連接的跨膜蛋白,通過形成膜內(nèi)原纖維構(gòu)成緊密連接的骨架,其羧基末端的PDZ結(jié)構(gòu)能與其他緊密連接蛋白分子相互作用,從而固定在緊密連接復(fù)合體上[3],在維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)黏附分子不僅對組織的完整性至關(guān)重要,而且參與多種細(xì)胞行為的信號傳導(dǎo),細(xì)胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子的不同組合可協(xié)調(diào)各種生理和病理過程,包括癌癥[4]。如,卵巢癌患者腹水中的腫瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞黏附和細(xì)胞屏障完整性相關(guān)的基因上調(diào)[5],CLDNs家族基因高表達(dá)于胃癌,有望作為胃癌治療的新靶標(biāo)[6]。目前研究發(fā)現(xiàn),腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、骨肉瘤中都檢測到CLDN8的異常表達(dá),且與細(xì)胞癌變及緊密連接功能缺失密切相關(guān)[7]。如,CLDN8在腎透明細(xì)胞癌中顯著低表達(dá),CLDN8被認(rèn)為可抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系通過上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和蛋白激酶B途徑進(jìn)行增生、轉(zhuǎn)化和侵襲的過程[8]。另外,CLDN8通過雄激素受體信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移[9];通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。CLDN8被檢測到在乳腺癌中低表達(dá)且與雄激素受體呈正相關(guān),具體機制未知[11]。體外實驗表明,CLDN8敲低可通過阻滯U2OS骨肉瘤細(xì)胞G1-S轉(zhuǎn)化,從而抑制骨肉瘤細(xì)胞系生長[12]。目前,關(guān)于CLDN8參與chRCC的發(fā)生發(fā)展的文獻(xiàn)較少見。本文擬通過收集全球范圍內(nèi)公共數(shù)據(jù)庫中chRCC組織相關(guān)數(shù)據(jù)集,分析CLDN8 mRNA在chRCC組織中的表達(dá)情況,并結(jié)合免疫組織化學(xué)染色(IHC)對臨床病理樣本進(jìn)行驗證,進(jìn)而探索CLDN8在chRCC中的臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 通過Gene Expression Omnibus(GEO)、Sequence Read Archive(SRA)、ArrayExpress數(shù)據(jù)庫獲取chRCC mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集,檢索式為“Kidney chromophobe”O(jiān)R“KICH”O(jiān)R“chromophil renal cell carcinoma”O(jiān)R“chromophobe renal cell carcinoma”O(jiān)R“chRCC”。檢索時間為建庫至2021年6月1日。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)數(shù)據(jù)集來源是人類;(2)包含組織mRNA測序數(shù)據(jù);(3)同時具有chRCC組和非chRCC組,非chRCC組為癌旁組織或正常腎組織,2組數(shù)目均大于或等于3。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)數(shù)據(jù)集來源是細(xì)胞;(2)經(jīng)過基因敲除或藥物處理。此外,通過R包TCGAbiolinks獲取癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中chRCC經(jīng)RNA測序的計數(shù)數(shù)據(jù)集(建庫至2021年7月12日),正常腎組織RNA測序基因讀取計數(shù)矩陣下載自Genotype-Tissue Expression(GTEx)數(shù)據(jù)庫。研究使用的組織芯片購買自桂林泛譜生物技術(shù)有限公司,包括11份chRCC組織標(biāo)本和16份非chRCC組織標(biāo)本(In-house TMA數(shù)據(jù)集)。本研究所用標(biāo)本、方法均獲得桂林泛譜生物技術(shù)有限公司和廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2方法 (1)技術(shù)路線:分析chRCC組織、非chRCC組織CLDN8 mRNA及蛋白表達(dá)差異,并通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線、匯總ROC(sROC)曲線及計算靈敏度、特異度、陽性似然比等指標(biāo),分析CLDN8對chRCC的診斷效能。(2)mRNA數(shù)據(jù)集處理:TCGA數(shù)據(jù)集與GTEx數(shù)據(jù)庫下載的正常腎組織RNA測序基因讀取計數(shù)矩陣經(jīng)過合并、批次處理、TPM(transcript per kilobase of exon model per million mapped reads)標(biāo)準(zhǔn)化形成一個獨立的TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集。最終,對沒有標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集進(jìn)行l(wèi)og2(x+1)歸一化處理用于后續(xù)分析。(3)CLDN8蛋白表達(dá)檢測:通過IHC來檢測CLDN8蛋白在chRCC中的表達(dá)情況,各步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。IHC結(jié)果將由2位病理專家分別按照免疫組化染色評分(IRS)系統(tǒng)(0~12分)進(jìn)行閱片評分[13]。染色強度分為0、1、2、3,分別表示陰性、弱、中、強。陽性染色比例分類如下:0為無細(xì)胞染色,1為小于10%,2為11%~50%,3為51%~80%,4為81%~100%。陽性染色比例與染色強度分?jǐn)?shù)的乘積即為對應(yīng)視野的最終得分。每個樣本取5個不同視野依照IRS評分系統(tǒng)進(jìn)行評分,最后取5個視野評分的算術(shù)平均數(shù)作為該樣本的最終得分。所有樣本的評分匯總作為一個數(shù)據(jù)集用于后續(xù)分析。兔抗人CLDN8多克隆抗體購自英國Abcam公司,第二抗體品名為中杉金橋(貨號:PV-6000),DAB顯色試劑盒(20×)購自福州邁新生物公司(貨號:DAB-0031)。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理 通過GraphPad Prism8.0.2軟件進(jìn)行非配對兩獨立樣本t檢驗分析CLDN8在chRCC組織與非chRCC組織中表達(dá)差異,繪制散點圖對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。分析ROC曲線獲得真陽性數(shù)、真陰性數(shù)、假陽性數(shù)、假陰性數(shù)。通過Stata12.0軟件合并標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)效應(yīng)量,計算靈敏度、特異度、似然比,繪制sROC曲線及發(fā)表偏倚檢驗漏斗圖。采用sROC曲線下面積(AUC)用于評估CLDN8潛在診斷效能,其中>0.5~0.7為診斷效能較低,>0.7~0.8為診斷效能一般,>0.8~0.9為診斷效能較高,>0.9為診斷效能很高。采用Deeks′漏斗圖和Egger′s檢驗評估發(fā)表偏倚檢驗。Q檢驗和I2可分別定性、定量進(jìn)行異質(zhì)性檢驗,若Q檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.10),表明研究存在異質(zhì)性,其中I2≤40%時異質(zhì)性可忽略不計;I2為30%~60%時存在一定程度異質(zhì)性;I2≥50%異質(zhì)性較明顯。當(dāng)Q檢驗P<0.10且I2>50%時,合并效應(yīng)量SMD選用隨機效應(yīng)模型,否則采用固定效應(yīng)模型。

    2 結(jié) 果

    2.1數(shù)據(jù)收集情況 從公共數(shù)據(jù)庫獲得4個數(shù)據(jù)集,分別是GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx,其中GSE11151數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本4份,非chRCC組織標(biāo)本5份;GSE15641數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本6份,非chRCC組織標(biāo)本23份;GSE26574數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本10份,非chRCC組織標(biāo)本8份;TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本65份,非chRCC組織標(biāo)本113份。相關(guān)數(shù)據(jù)集獲取流程圖見圖1。

    圖1 數(shù)據(jù)集獲取流程圖

    2.2chRCC組織與非chRCC組織中CLDN8表達(dá)水平比較 chRCC組織CLDN8 mRNA表達(dá)水平高于非chRCC組織,但僅在TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A~D。免疫組化結(jié)果顯示,與非chRCC組織比較,chRCC組織細(xì)胞成片排列,無明顯結(jié)構(gòu),細(xì)胞體積增大,核大深染,CLDN8蛋白定位于細(xì)胞漿,在chRCC組織中呈強陽性表達(dá)。見圖3~4。chRCC組織CLDN8蛋白表達(dá)水平與非chRCC組織比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖5。

    A~D.基于公共數(shù)據(jù)集的CLDN8 mRNA表達(dá)水平比較。

    A.腎小管;B.腎小球。

    A.腎小管;B.腎小球。

    圖5 基于In-house TMA數(shù)據(jù)集的CLDN8蛋白表達(dá)水平比較

    2.3數(shù)據(jù)集分析結(jié)果 各數(shù)據(jù)集存在顯著異質(zhì)性(I2=82.4%,P<0.000 1),采用隨機效應(yīng)模型分析。GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx、In-house TMA數(shù)據(jù)集SMD分別為1.27(95%CI:-0.21~2.74)、0.41(95%CI:-0.50~1.31)、0.46(95%CI:-0.48~1.40)、1.01(95%CI:0.69~1.33)、4.12(95%CI:2.74~5.49)。5個數(shù)據(jù)集合并SMD為1.33(95%CI:0.39~2.27)。Deeks′漏斗圖和Egger′s檢驗顯示,各數(shù)據(jù)集不存在發(fā)表偏倚(P>0.05)。見圖6。CLDN8診斷chRCC的sROC曲線AUC為0.93(95%CI:0.90~0.95),靈敏度為0.86(95%CI:0.70~0.94),特異度為0.87(95%CI:0.71~0.95),陽性似然比為6.78(95%CI:2.53~18.15),陰性似然比為0.17(95%CI:0.07~0.39)。見圖7、表1。

    表1 各數(shù)據(jù)集靈敏度、特異度、陽性和陰性似然比

    續(xù)表1 各數(shù)據(jù)集靈敏度、特異度、陽性和陰性似然比

    A.Deeks′漏斗圖;B.Egger′s漏斗圖。

    A~E.不同數(shù)據(jù)集的ROC曲線;F.sROC曲線(①為GSE11151,②為GSE15641,③為GSE26574,④為TCGA-GTEx,⑤為In-house TMA)。

    3 討 論

    chRCC是常見的腎腫瘤亞型,約占腎腫瘤患者的5%[14],目前臨床仍以病理學(xué)診斷方法確診。隨著測序技術(shù)及分子靶向治療的發(fā)展,生物學(xué)標(biāo)記物成為當(dāng)前臨床診斷的發(fā)展方向。CLDN8在構(gòu)建細(xì)胞緊密連接、維持細(xì)胞屏障功能、細(xì)胞間分子傳遞過程中發(fā)揮重要作用,近年來被認(rèn)為與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。本研究不僅從mRNA水平分析了CLDN8在chRCC中的表達(dá)水平,而且驗證了CLDN8蛋白的異常表達(dá)。

    共85例chRCC樣本和149例對照樣本的mRNA測序數(shù)據(jù)用于檢測CLDN8在轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)差異,11例chRCC樣本與16例對照樣本用于CLDN8蛋白驗證。本研究結(jié)果顯示,TCGA-GTEx、In-house TMA數(shù)據(jù)集中CLDN8在chRCC組織中具有顯著上調(diào)趨勢(P<0.000 1),GSE11151、GSE15641、GSE26574 3個數(shù)據(jù)集中CLDN8表達(dá)上調(diào)差異不顯著,其原因可能是樣本量不足所致。本研究結(jié)果顯示,CLDN8診斷chRCC的sROC曲線AUC為0.93,靈敏度為0.86,特異度為0.87,陽性似然比為6.78,陰性似然比為0.17。提示對于chRCC,CLDN8具有較高的診斷效能。已有研究證明,CLDN8上調(diào)與多種惡性腫瘤相關(guān),其在結(jié)直腸癌中高表達(dá),可能通過MAPK/ERK信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。ASHIKARI等[9]研究認(rèn)為,CLDN8是雄激素調(diào)節(jié)基因,可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。此外,miR-361-5p通過靶向抑制CLDN8的表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[16]。本研究結(jié)果顯示,CLDN8在chRCC中呈異常高表達(dá)趨勢,但其具體機制未知。提示,CLDN8在chRCC中上調(diào),可能參與了chRCC的發(fā)展進(jìn)程。

    綜上所述,CLDN8高表達(dá)可能與chRCC形成與進(jìn)展相關(guān)。本研究存在一定局限性:如納入樣本數(shù)不多、異質(zhì)性來源不清楚、沒有明確揭示CLDN8參與chRCC的機制。未來需要更多的研究來揭示CLDN8在chRCC中異常高表達(dá)的分子機制。

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