血清甘露糖結(jié)合凝集素、甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶-2在IgA腎病中的作用

王英杰，米 焱，王彩麗

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

IgA腎病(IgA Nephropathy，IgAN)是常見的原發(fā)性腎小球腎炎類型,尤以亞洲地區(qū)多見[1]。IgAN起病隱匿，臨床進(jìn)展各不相同，首次臨床表現(xiàn)后20～30年，有30 %～40 %的患者發(fā)展到終末期腎臟疾病[2]。IgAN患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，平均預(yù)期壽命減少6年[3]。IgAN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，被認(rèn)為是一種由免疫介導(dǎo)的疾病。近年來(lái)研究表明補(bǔ)體甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)途徑參與IgAN發(fā)生發(fā)展[4]，但確切機(jī)制尚未完全清楚，且其相關(guān)組分在疾病中的表達(dá)情況及意義仍無(wú)一致性結(jié)論。MBL途徑的活性主要取決于MBL和MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases, MASP)-2濃度[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)IgAN患者外周血循環(huán)中MBL及MASP-2濃度，重點(diǎn)分析其與臨床指標(biāo)、病理指標(biāo)的關(guān)系，探討MBL途徑關(guān)鍵分子MBL、MASP-2在IgAN中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2020年12月～2021年12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺活檢病理診斷為IgAN的患者33例為IgAN組，男性12例，女性21例，平均年齡(36.00±20.00)歲。選取同期體檢的健康志愿者33例為對(duì)照組，男女比例與IgAN組一致，平均年齡(35.00±17.00)歲，體檢指標(biāo)正常，無(wú)腎病、自身免疫性疾病、感染性疾病、糖尿病、腫瘤疾病。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象在參與研究時(shí)均簽訂知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)光鏡報(bào)告中腎活檢組織可見腎小球數(shù)≥10個(gè)；(2)免疫熒光腎小球系膜區(qū)以IgA沉積為主，符合IgAN的診斷；(3)腎臟穿刺時(shí)eGFR≥15 mL/(min·1.73m2)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未滿18周歲；(2)妊娠期；(3)既往使用過(guò)激素或免疫抑制劑；(4)繼發(fā)性IgAN，如過(guò)敏性紫癜；(5)伴發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、糖尿病、糖尿病腎病、病毒性肝炎、肝硬化、腫瘤、艾滋病以及存在泌尿道感染等疾病。

1.2方法

1.2.1一般資料 收集整理IgAN組患者的一般資料，包括性別、年齡、疾病史、是否患高血壓。臨床指標(biāo)：血尿、24h尿蛋白定量(24 hours urinary protein，24hUP)、血白蛋白(albumin，ALB)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血尿酸(uric acid，UA)、估算腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesferol，LDL-C)、血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)、血清免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、血清免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)、血清免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、血清補(bǔ)體C3(Complement 3，C3)、血清補(bǔ)體C4(Complement 4，C4)。腎活檢報(bào)告信息：牛津分型中MEST-C[6]評(píng)分，腎小球IgG、IgA、IgM、C3免疫熒光沉積強(qiáng)度。

注 ：①高血壓：根據(jù)中國(guó)腎性高血壓管理指南2016(簡(jiǎn)版)[7]進(jìn)行診斷。②血尿：高倍鏡尿沉渣鏡檢紅細(xì)胞計(jì)數(shù)<3個(gè)為“-”，計(jì)為“0”；3-9個(gè)為“±”，計(jì)為“1”；10-19個(gè)為“+”，計(jì)為“1”；20-29個(gè)為“++”，計(jì)為“2”；30-39個(gè)為“+++”，計(jì)為“3”；≥40個(gè)為“++++”，計(jì)為“4”。③牛津分型[6]MEST-C評(píng)分：M表示系膜細(xì)胞增殖(光鏡下50 %及以上的腎小球系膜區(qū)不足3個(gè)系膜細(xì)胞為M0，50 %及以上的腎小球系膜區(qū)3個(gè)及以上系膜細(xì)胞為M1)，計(jì)“M0、M1”；E表示腎小球毛細(xì)血管內(nèi)增生(無(wú)為E0，有為E1)，計(jì)“E0、E1”；S表示腎小球節(jié)段硬化(無(wú)為S0，有為S1)，計(jì)“S0、S1”；T表示腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化(腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化受累面積≤25 %為T0，26 %～50 %為T1，>50 %為T2)，計(jì)“T0、T≥1(腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化受累面積>25 %)”；C表示細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體(無(wú)新月體為C0，至少有1個(gè)腎小球有新月體，且有新月體腎小球的<25 %為C1，≥25 %的腎小球有新月體為C2)，計(jì)“C0、C≥1(有新月體)”。④腎小球IgA、IgG、IgM、C3免疫熒光沉積強(qiáng)度：用“-、1+、2+、3+、4+”表示，計(jì)為“0、1、2、3、4”。⑤eGFR使用中國(guó)校正簡(jiǎn)化MDRD公式計(jì)算。

1.2.2血清采集及處理 在腎活檢(IgAN組)或納入研究(健康對(duì)照組)當(dāng)日用一次性無(wú)菌干燥真空促凝管取空腹外周靜脈血4～5 mL，1 h內(nèi)進(jìn)行離心(3 000 r/min，10 min)，取上層血清分裝于2 mL無(wú)酶EP管，超低溫冰箱-80 ℃恒溫保存，待測(cè)。

1.3試劑及檢測(cè)方法 所用人MBL、MASP-2 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，按照人MBL、MASP-2 ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀(450 nm波長(zhǎng)下)測(cè)定吸光值(OD值)，分別計(jì)算得到兩組血清標(biāo)本MBL及MASP-2濃度。

2 結(jié)果

2.1兩組血清MBL濃度比較 IgAN組(IgAN)血清MBL濃度服從正態(tài)分布、健康對(duì)照組(Control)血清MBL濃度呈偏態(tài)分布。IgAN組(IgAN)血清MBL濃度為(1 096.99±584.73 )ng/mL，健康對(duì)照組(Control)血清MBL濃度為453.50(363.16,1 092.06)ng/mL。IgAN組(IgAN)血清MBL濃度高于健康對(duì)照組(Control)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。見圖1。

圖1 健康對(duì)照組與IgAN組血清MBL濃度比較

2.2兩組血清MASP-2濃度比較 IgAN組(IgAN)、健康對(duì)照組(Control)血清MASP-2濃度均不服從正態(tài)分布。IgAN組(IgAN)血清MASP-2濃度為435.41(248.22,649.99)pg/mL，健康對(duì)照組(Control)血清MASP-2濃度為396.59(107.40,637.42)pg/mL。IgAN組(IgAN)血清MASP-2濃度與健康對(duì)照組(Control)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.33)。見圖2。

2.3血清MBL與MASP-2濃度的相關(guān)性分析 IgAN組的血清MBL濃度與MASP-2濃度呈正相關(guān)(r=0.40，P=0.02)；健康對(duì)照組的血清MBL濃度與MASP-2濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.60，P=0.00003)。

2.4IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與一般資料的相關(guān)性分析 IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與年齡、性別及是否患高血壓均無(wú)相關(guān)性。見表1。

圖2 健康對(duì)照組與IgAN組血清MASP-2濃度比較

表1 IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與一般資料的相關(guān)性分析

2.5IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 IgAN患者血清MBL濃度與24hUP呈正相關(guān)(r=0.36，P=0.04)、與LDL-C水平呈正相關(guān)(r=0.49，P=0.004)、與UA水平呈正相關(guān)(r=0.35，P=0.048)，與ALB水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.35，P=0.048)。IgAN患者血清MBL濃度與血尿、Scr、BUN、eGFR、TG、LDL-C、ESR、血清IgG、血清IgA、血清IgM、血清補(bǔ)體C3、血清補(bǔ)體C4均無(wú)顯著相關(guān)性。IgAN患者血清MASP-2濃度與ESR呈正相關(guān)(r=0.51，P=0.005)。IgAN患者血清MASP-2濃度與血尿、24hUP、Scr、BUN、eGFR、TG、LDL-C、ESR、血清IgG、血清IgA、血清IgM、血清補(bǔ)體C3、血清補(bǔ)體C4均無(wú)顯著相關(guān)性。見表2。

2.6IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 IgAN患者血清MBL濃度與T0呈負(fù)相關(guān)(r=-0.352，P=0.045)，IgAN患者血清MBL濃度與T≥1呈正相關(guān)(r=0.352，P=0.045)。IgAN患者血清MBL濃度與M0、M1、E0、E1、S0、S1、C≥0、C≥1無(wú)相關(guān)性，與腎小球IgG、IgA、IgM、C3的沉積強(qiáng)度無(wú)相關(guān)性。IgAN患者血清MASP-2濃度與M0、M1、E0、E1、S0、S1、T≥0、T≥1、C≥0、C≥1病變無(wú)相關(guān)性，與腎小球IgG、IgA、IgM、C3的沉積強(qiáng)度亦無(wú)相關(guān)性。見表3。

表2 IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

表3 IgAN患者血清MBL、MASP-2濃度與病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

補(bǔ)體MBL途徑是免疫系統(tǒng)的重要組成，MBL是激活該途徑的啟動(dòng)因子，被認(rèn)為是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。在病原體感染的早期，MBL由肝細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，能與病原體表面甘露糖殘基結(jié)合，活化MASPs，其中MASP-2是該途徑的主要酶，能裂解C4和C2，級(jí)聯(lián)激活補(bǔ)體末端通路，形成攻膜復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)作用。盡管MBL途徑是機(jī)體免疫系統(tǒng)的防御機(jī)制，但也可能在疾病進(jìn)展中發(fā)揮不利的作用。目前被廣泛認(rèn)同的是補(bǔ)體MBL途徑參與IgAN發(fā)生發(fā)展，但其相關(guān)分子在IgAN中的表達(dá)及意義尚存在爭(zhēng)議。

本研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者血清MBL濃度較健康志愿者高，與朱林波[8]IgAN 患者組(186例)血清MBL水平高于健康對(duì)照組的研究結(jié)果一致，提示血清中高濃度的MBL可能參與IgAN疾病過(guò)程。根據(jù)MBL在免疫反應(yīng)早期識(shí)別并結(jié)合N-乙酰半乳糖胺的特性，推測(cè)MBL在IgAN患者血清中濃度偏高可能與其在疾病早期或者疾病活動(dòng)狀態(tài)激活增多有關(guān)。

但也有研究[9-10]未發(fā)現(xiàn)IgAN患者血MBL濃度與健康人群間有差異。IgAN患者血MBL水平可能會(huì)受到種族、地域、環(huán)境因素的影響。國(guó)內(nèi)Guo等[11]同樣未發(fā)現(xiàn)IgAN患者與健康人群血MBL濃度的差異，但發(fā)現(xiàn)血MBL水平較低的IgAN患者感染和血尿的發(fā)生率較高，而MBL水平過(guò)高的IgAN患者有更嚴(yán)重的蛋白尿和高新月體比例。

本研究未觀察到IgAN患者血清MBL濃度與血尿及腎小球新月體的相關(guān)性，但觀察到IgAN患者血清MBL濃度高于健康志愿者，且高水平的血清MBL與尿蛋白定量、血白蛋白水平及高尿酸血癥相關(guān)，血清MBL水平升高可能預(yù)示IgAN疾病進(jìn)展。

本研究還關(guān)注到IgAN組血清MBL濃度與低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)。“脂質(zhì)腎毒性假說(shuō)”認(rèn)為慢性進(jìn)行性腎病可能是由脂質(zhì)代謝異常介導(dǎo)的，腎臟疾病伴發(fā)血脂異常，血脂異常加重腎組織損傷。近期也有報(bào)道[14]稱較高的低密度脂蛋白膽固醇水平與顯著較高的慢性腎臟病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此推測(cè)MBL途徑異?；罨瘏f(xié)同脂代謝異常導(dǎo)致IgAN腎組織損傷。

不僅如此，相關(guān)性分析顯示IgAN患者血清MBL濃度與T0及T≥1均存在相關(guān)關(guān)系，提示高濃度的血清MBL可能參與IgAN腎小管/間質(zhì)損傷，腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化被認(rèn)為是反應(yīng)IgAN疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一[15]，因此推測(cè)循環(huán)中較高濃度的MBL可能通過(guò)參與腎小管/間質(zhì)損傷加重IgAN疾病過(guò)程。

目前關(guān)于MASP-2在IgAN患者血清中表達(dá)的研究尚少。本研究與鄭林花等[16]的研究結(jié)果一致，同樣未發(fā)現(xiàn)IgAN組與健康對(duì)照組間血清MASP-2濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但鄭林花等[16]的研究發(fā)現(xiàn)血清MASP-2濃度較低的IgAN患者肉眼血尿發(fā)生率較高，而血清MASP-2濃度較高的IgAN患者尿蛋白較多、腎小球系膜增生更明顯，他們認(rèn)為過(guò)多或過(guò)少的MASP-2激活似乎都對(duì)IgAN發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生有害影響，此外，生存曲線分析顯示過(guò)高或過(guò)低的血清MASP-2濃度均導(dǎo)致患者腎臟生存率偏低，與Guo等[11]觀察到的MBL在IgAN患者循環(huán)中表達(dá)的特點(diǎn)相似。遺憾的是，本研究中未觀察到血清MASP-2濃度與血尿、蛋白尿、腎功能及病理指標(biāo)間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者中高濃度血清MASP-2與更快的血沉相關(guān)，血沉增快可能與補(bǔ)體MBL途徑激活導(dǎo)致疾病處于慢性炎癥狀態(tài)有關(guān)。

值得重視的是，正常生理狀態(tài)下補(bǔ)體系統(tǒng)精密而平衡，MASP-2由MBL活化后激活，均為MBL途徑的關(guān)鍵組分，其表達(dá)水平似乎應(yīng)該存在較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系，但本研究中IgAN組患者血清MBL與MASP-2僅呈弱的正相關(guān)(r=0.40)，而在健康對(duì)照組中觀察到了強(qiáng)的負(fù)相關(guān)(r=-0.60)。猜測(cè)一, IgAN患者血MASP-2濃度可能隨MBL的過(guò)度活化而增高，而在健康人血液循環(huán)中,相對(duì)較低水平的MBL可能對(duì)MASP-2的產(chǎn)生存在某種程度的抑制，推測(cè)MBL與MASP-2表達(dá)水平的失衡或是兩者間的“穩(wěn)態(tài)”被打破，可能誘導(dǎo)或推進(jìn)MBL途徑的異?；罨?，這會(huì)不會(huì)是IgAN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。猜測(cè)二，盡管MBL途徑主要模式識(shí)別分子是MBL，還有其他多種模式識(shí)別分子參與補(bǔ)體途徑的激活，可以活化MASPs，因此猜測(cè)在IgAN中可能還有其他模式識(shí)別分子參與MASP-2的活化，并可能在該病中起一定作用。猜測(cè)三，MBL具有多種復(fù)雜的功能，不僅僅參與MBL途徑，因此MBL可能在IgAN患者的循環(huán)中還參與其他腎損傷機(jī)制，均有待進(jìn)一步研究的證實(shí)。

綜上，補(bǔ)體MBL途徑參與IgAN的疾病過(guò)程，高濃度血清MBL在IgAN患者尿蛋白排泄增多、血白蛋白降低、嘌呤代謝異常以及脂代謝異常、腎小管/間質(zhì)損傷中起重要作用，提示高濃度的血清MBL可能是IgAN發(fā)生發(fā)展的重要因素。高水平的血清MASP-2伴隨血沉更快，可能是IgAN中持續(xù)的MBL途徑激活及疾病慢性炎癥狀態(tài)的結(jié)果。