RS3PE綜合征患者血清MMP-3、TIMP1/2、SPP1和PLG表達(dá)水平及其相關(guān)性研究*

于江銳，閆慧明

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

緩解性血清陰性對(duì)稱性滑膜炎伴凹陷性水腫(Remissive seronegative symmetric synovitis with depressed edema,RS3PE)是一種罕見的風(fēng)濕病，其特征為急性發(fā)作對(duì)稱性滑膜炎、手背點(diǎn)狀水腫、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor,RF)陰性以及對(duì)小劑量糖皮質(zhì)激素效果顯著，往往影響≥50歲的患者[1-2]。RS3PE的確切患病率目前仍不清楚。RS3PE與多種腫瘤和炎癥性疾病相關(guān)，通?？勺鳛檫@些疾病的初始表現(xiàn)。來自合并病例報(bào)告的數(shù)據(jù)估計(jì)，RS3PE相關(guān)惡性腫瘤的全球發(fā)病率為20.0 %,實(shí)體瘤比血液系統(tǒng)惡性腫瘤更普遍，占相關(guān)RS3PE病例的75.0 %[3]。胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤更常見，腺癌是最常見的腫瘤[4]。大多數(shù)與RS3PE相關(guān)的惡性腫瘤將在RS3PE最初診斷后的4年內(nèi)檢測(cè)到。因此，對(duì)于RS3PE的早期診斷和篩查對(duì)預(yù)防腫瘤非常必要。

基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metallopro-teinase-3,MMP-3)是一種由滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激作用下產(chǎn)生的蛋白酶。RS3PE綜合征會(huì)導(dǎo)致滑膜炎癥并上調(diào)MMP-3的表達(dá)，使血清MMP-3水平升高[5]，因此檢測(cè)患者血清MMP-3水平可能支持診斷并反映疾病狀態(tài)，且比CRP更敏感[6]。MMP-3已知在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌和基底細(xì)胞癌中產(chǎn)生。因此，如果在RS3PE綜合征中MMP-3水平升高，則必須考慮與惡性腫瘤相關(guān)的并發(fā)癥?；颊甙l(fā)病后2～3年內(nèi)常伴有惡性腫瘤[7]。血清高水平的MMP-3是RS3PE綜合征合并惡性腫瘤的有意義的生物標(biāo)志物[8]。因此，尋找與MMP-3類似的生物標(biāo)記物對(duì)RS3PE的早期篩查尤為關(guān)鍵。本研究以生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行了RS3PE靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并進(jìn)一步對(duì)MMP-3相關(guān)蛋白互作靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。隨后結(jié)合RS3PE臨床病例，檢測(cè)了患者血清中相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)變化，并與RS3PE疾病活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo)血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和CRP做了相關(guān)性分析，為臨床篩選RS3PE生物標(biāo)記物提供了重要參考。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2020年5月～2021年7月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診治的RS3PE綜合征患者21例為RS3PE組,選擇與其年齡相匹配的健康體檢者30例作為對(duì)照組(CON組)。觀察指標(biāo)包括：RF、ESR、CRP、X線表現(xiàn)、磁共振成像(MRI)表現(xiàn)。

根據(jù)McCarty等[9]提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)作為納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)起病急；(2)多老年起病；(3)多關(guān)節(jié)炎雙側(cè)對(duì)稱并伴有肢端的可凹陷性水腫；(4)關(guān)節(jié)炎為非侵蝕性；(5)血清類風(fēng)濕因子呈陰性；(6)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療效果佳。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并有嚴(yán)重感染、心血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)疾病、血液系統(tǒng)疾病、腎臟疾病或其他代謝性疾病、炎性腸病者及合并其他結(jié)締組織病者；排除長(zhǎng)久口服抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)、激素者。標(biāo)本收集：患者和健康對(duì)照者早晨空腹抽取5 mL靜脈血，離心后吸取血清于EP管中，放置于-80 ℃冰箱中待檢。qRT-PCR及ELISA檢測(cè)的具體實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。本研究受試者均知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2方法 RS3PE的疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中以“RS3PE”為檢索詞，獲取RS3PE的相關(guān)靶點(diǎn)。

MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：在string-db數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)和genemania數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genemania.org/)中以“MMP-3”為檢索詞，獲取RS3PE的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；通過Venny軟件對(duì)string-db數(shù)據(jù)庫(kù)和genemania數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)的MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)蛋白取交集，明確MMP-3關(guān)鍵相關(guān)靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1RS3PE的疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)RS3PE的疾病靶點(diǎn)有2個(gè)，分別為MMP-3和CRP。見圖1。

圖1 RS3PE的疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)圖

2.2MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過string-db數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)有11個(gè)，通過genemania數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)有21個(gè)，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)通過Venny軟件取交集，有共同靶點(diǎn)5個(gè)，分別為MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP2)、血清骨橋素1(serum bone bridging protein 1，SPP1)及纖溶酶原(plasminogen，PLG)。見圖2。

圖2 string-db數(shù)據(jù)庫(kù)和genemania數(shù)據(jù)庫(kù)交集圖

2.3兩組患者基本臨床特點(diǎn)比較 與CON組相比，RS3PE組ESR、CRP水平均升高(P<0.05)；而兩組間年齡和RF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖3。

表1 兩組患者臨床特點(diǎn)比較

圖3 兩組患者ESR、CRP、RF水平比較圖

2.4兩組患者各因子基因水平結(jié)果 與CON組相比，RS3PE組MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1 mRNA水平均升高(P<0.05)；而PLG mRNA水平兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者各因子基因水平比較

2.5兩組患者各因子水平結(jié)果 與CON組相比，RS3PE組MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平均升高(P<0.05)；而兩組間PLG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖4。

表3 兩組患者各因子水平比較

圖4 兩組患者M(jìn)MP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1/PLG水平比較圖

2.6MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平與ESR、CRP相關(guān)性分析 結(jié)果顯示：MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平與ESR、CRP均呈明顯正相關(guān)。見表4，圖5，圖6。

圖5 MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平與ESR相關(guān)性分析圖

圖6 MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平與CRP相關(guān)性分析圖

表4 RS3PE患者血清中MMP-3、SPP1、TIMP1、TIMP2含量與ESR、CRP的相關(guān)性分析[r(P)]

3 討論

McCarty等[9-13]于1985年首次描述了RS3PE綜合征。有報(bào)道指出，RS3PE常合并惡性腫瘤。因此對(duì)RS3PE早期診斷、篩查對(duì)預(yù)防腫瘤的發(fā)生具有重要意義。為了探究RS3PE患者血清中MMP-3變化規(guī)律，篩選出有價(jià)值的能夠反映疾病狀態(tài)的標(biāo)志物，本研究首先對(duì)RS3PE的靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)RS3PE的疾病靶點(diǎn)共有2個(gè)，分別為MMP-3和CRP。這與之前的研究結(jié)果一致。本研究對(duì)21例RS3PE患者進(jìn)行了血清ESR及CRP檢測(cè)，結(jié)果顯示二者水平均明顯高于CON組。眾所周知，MMPs是一個(gè)參與腫瘤侵襲的蛋白水解酶家族，該家族的幾個(gè)成員已被證明與腫瘤預(yù)后相關(guān)[14]。據(jù)報(bào)道，大腸癌患者血清中MMP-3和MMP-9表達(dá)增加[15]。MMP-3水平升高也見于一些泌尿系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、基底細(xì)胞癌[16]。這些數(shù)據(jù)表明，MMP-3水平的升高可能與實(shí)體癌的進(jìn)展或浸潤(rùn)有關(guān)。RS3PE患者血清MMP-3顯著升高可能反映了癌組織和滑膜組織原位產(chǎn)生MMP-3，相對(duì)較高的CRP和ESR水平可能也與MMP-3有關(guān)。

大量數(shù)據(jù)文獻(xiàn)及本研究已經(jīng)證實(shí)MMP-3在RS3PE患者中的應(yīng)用價(jià)值，深度挖掘與MMP-3相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)臨床具有重要價(jià)值。本研究對(duì)21例RS3PE患者血清MMP-3基因和蛋白水平與ESR和CRP水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MMP-3水平與ESR和CRP水平呈明顯正相關(guān)，這提示MMP-3可反映疾病的活動(dòng)度。本研究又進(jìn)一步應(yīng)用生物信息學(xué)方法通過string-db數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)有11個(gè)，通過genemania數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MMP-3相關(guān)靶點(diǎn)有21個(gè)。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)通過Venny軟件取交集，有共同靶點(diǎn)5個(gè)，分別為MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1、PLG?；谝陨辖Y(jié)果，本研究利用ELISA檢測(cè)了21例RS3PE患者及30例健康對(duì)照組的MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1、PLG水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RS3PE組MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平明顯升高，而PLG水平無明顯變化，提示TIMP1、TIMP2、SPP1水平與MMP-3水平關(guān)系密切，可能在RS3PE患者疾病發(fā)展中扮演重要的角色。

TIMPs為MMPs的特異性阻斷劑，由胱氨酸和色脯氨酸殘基形成高度緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其氨基酸末端的半胱氨酸殘基與活化的MMP按照1∶1結(jié)合成MMP-TIMP復(fù)合物，進(jìn)而抑制MMPs的酶活性以及細(xì)胞增殖，阻斷其與作用底物相結(jié)合[17]。當(dāng)MMPs活性明顯高于TIMPs時(shí)，破壞MMPs/TIMPs平衡，會(huì)引起軟骨受損。TIMP-1和TIMP-2表達(dá)于巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織，大多數(shù)細(xì)胞因子能刺激其表達(dá)，這其中包括活化的MMP-3和MMP-9，同時(shí)亦可對(duì)RA滑膜血管侵襲起到阻斷效果[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過對(duì)SCID鼠進(jìn)行TIMP-1和TIMP-2轉(zhuǎn)染，可引起RA的侵襲力與增殖下降，提示TIMP不但能抑制MMPs，還能使滑膜細(xì)胞等組織的功能受到抑制[19]?；顒?dòng)期RA患者血清MMP-3、TIMP-1、TIMP-2水平明顯升高，MMP-3/TIMP-1/TIMP-2失衡可能對(duì)RA的發(fā)展進(jìn)程影響重大。MMP-3/TIMP-1/TIMP-2失衡會(huì)導(dǎo)致滑膜巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，這可加劇RA損傷[20]。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期RA患者血清MMP-3升高程度大于TIMP-1，TIMP-1不能顯著抑制MMP-3的活性，其比例失衡促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨的降解，所以MMP-3/TIMP-1較正常組升高，表明MMP-3/TIMP-1在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用[21]。以上報(bào)道提示TIMP-1、TIMP-2在RA中表達(dá)水平改變與RA發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而有學(xué)者認(rèn)為RS3PE為RA的一種特殊類型，這也間接說明TIMP-1、TIMP-2可能在RS3PE發(fā)展進(jìn)程中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，RS3PE患者TIMP-1、TIMP-2水平明顯增加，且與ESR和CRP水平呈明顯正相關(guān)，驗(yàn)證了本研究的假設(shè)。

SPP1是最近發(fā)現(xiàn)由成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白同源的促炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞表面與其受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和遷移，在細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[22]。研究表明，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞可在SPP1的調(diào)控下導(dǎo)致骨代謝改變。SPP1濃度在絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松、RA繼發(fā)骨質(zhì)疏松患者中明顯升高，提示SPP1作為骨代謝指標(biāo)，可能參與了骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的發(fā)生[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，RS3PE患者SPP1水平明顯增加，且與ESR和CRP水平呈明顯正相關(guān)，這提示SPP1可能參與了RS3PE的發(fā)展，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

總之，本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了RS3PE的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)及探討了與RS3PE疾病活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，證實(shí)了MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1四種因子的表達(dá)變化與RS3PE的發(fā)展密切相關(guān)。但是由于本研究樣本量的限制，其具體作用機(jī)制尚未完全闡明，還需要更進(jìn)一步的研究。RS3PE患者PLG水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于樣本量小的限制或病程等因素的影響，在后續(xù)研究的過程中會(huì)持續(xù)關(guān)注。