宿半夏凝集素基因的克隆與分析

朱艷芳，朱 斌，梁志鵬，董 慶，薛 濤，盛 瑋

（1.淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000；2.安徽省特色資源植物利用工程實驗室，安徽 淮北 235000）

0 引言

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit為天南星科半夏屬多年生草本植物，其塊莖為主要的藥用部位，是一種常用的中草藥. 半夏在中藥處方中的使用率位居前列，有著很高的藥用價值［1］. 半夏始載于《神農本草經(jīng)》，中國藥典記載其功效為燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等，可用于治療濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等，外治癰腫痰核. 現(xiàn)代臨床應用中，證明半夏具有治療惡性腫瘤的重要作用［2］. 目前，普遍認為半夏提取物以及半夏化學成分中的半夏蛋白、半夏總生物堿、谷甾醇和半夏多糖等都具有抗腫瘤作用［3］.

半夏蛋白是半夏的主要藥效成分之一，主要由半夏胰蛋白酶抑制劑和半夏凝集素組成［4］. 半夏凝集素屬于單子葉甘露糖凝集素，能夠識別并特異性的結合甘露糖，具有抑菌、殺蟲、凝血和抗腫瘤等多種生理功能［5-10］. 由于半夏凝集素的生理功能多樣，對半夏凝集素的研究一直是個熱點，其研究多集中于對該蛋白的提取純化［4，11］、功能研究［3-4，12］、基因克?。?3］、異源轉化［8，14］等方面. 宿半夏是分布于皖北的道地藥材，尚未見針對宿半夏凝集素的相關報道. 因此，本研究以宿半夏的塊莖為試驗材料，對其凝集素基因進行克隆和生物信息學分析，為進一步研究宿半夏凝集素及深入開發(fā)宿半夏資源利用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用半夏為安徽道地藥材宿半夏P.ternata的新鮮塊莖. 宿半夏塊莖盆栽于淮北師范大學生命科學學院生物化學與分子生物學實驗室，以盆栽宿半夏葉柄為外植體，經(jīng)消毒后接種于MS基本培養(yǎng)基，獲得宿半夏無菌苗，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光暗周期為12 h/12 h，光照強度為2 000 lx.

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取、檢測及反轉錄

以無菌組培的半夏新鮮塊莖為材料，上海生工Total RNA Extractor（Trizol）試劑提取新鮮塊莖總RNA，利用微量分光光度計檢測總RNA 的質量和濃度. 高質量的RNA 用莫納生物反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 引物設計與合成

根據(jù)半夏塊莖發(fā)育轉錄組測序數(shù)據(jù)結合Genbank數(shù)據(jù)庫登錄半夏屬凝集素基因序列，設計半夏凝集素基因（PtPTA）上下游引物，用于半夏凝集素基因的克隆，引物序列為：

PTA-F：5’-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC-3’

PTA-R：5’-TTAATTCACCTTCTCCGTCACCATG-3’

1.2.3PtPTA克隆、膠回收及測序

以cDNA為模板，PTA-F、PTA-R為引物進行PCR擴增反應. PCR產物經(jīng)質量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目標基因，并與克隆載體pMD18-T連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落，37 ℃在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng). 以載體通用引物做菌落PCR檢測，將陽性轉化子送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序.

1.2.4 生物信息學分析

將測序獲得的PtPTA序列進行在線分析和軟件分析：用NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在線查找序列的最大開放閱讀框；用在線分析工具ProtParam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam/html）分析蛋白質的基本性質；在NCBI 網(wǎng)站的Conserved Domain Database 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析蛋白質保守結構域；用DNAMAN 軟件將天南星科不同來源的數(shù)種凝集素蛋白質序列進行多序列比對（參數(shù)均為默認值）；用MEGA7.0 構建系統(tǒng)進化樹（Bootstrap 為1 000）；用WoLF PSORT（http://wolfpsort.hgc.jp）對該蛋白進行亞細胞定位預測；用TMHMM Serer V2.0對蛋白進行跨膜結構預測；用SOMPA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線預測蛋白質的二級結構；用SWISS-MODEL（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）在線預測蛋白質的3D結構.

2 結果與分析

2.1 半夏塊莖總RNA質量檢測

電泳檢測提取半夏塊莖RNA 質量，結果如圖1 所示. 分別得到3 條清晰的RNA 條帶，即28S、18S 和5S RNA條帶，其中28S RNA 條帶的亮度是18S RNA條帶亮度的2倍，說明提取的總RNA完整性好，幾乎無降解. 超微量分光光度計檢測樣品RNA的A260/A280為1.913，A260/A230為0.998，結果顯示樣品的RNA純度高，污染少，可用于后續(xù)的基因克隆實驗.

圖1 RNA凝膠電泳圖

2.2 半夏凝集素基因（PtPTA）的克隆及測序

以cDNA為模板，以PTA-F，PTA-R為引物，PCR 擴增PtPTA. 將PCR產物凝膠電泳，其電泳結果如圖2所示. 與Marker相比，在750 bp和1 000 bp之間有一條明亮的帶，得到約800 bp特異片段.

圖2 PCR產物電泳結果圖

對PCR擴增所得條帶膠回收并測序，獲得一條開放閱讀框全長為810 bp的序列，編碼269個氨基酸（圖3）. 將目的基因編碼的蛋白質與NCBI中登錄的其它6種半夏植物凝集素蛋白進行序列比對，結果顯示，幾種半夏植物凝集素的同源性比較高，一致性達到97.82%（圖4）.

圖3 PtPTA全長cDNA序列及其推導氨基酸序列

2.3 PtPTA編碼蛋白（PTA）特性分析

2.3.1 PTA理化性質

理化性質分析結果顯示，PTA 蛋白的分子式為C1305H2028N354O391S11，由269 個氨基酸殘基組成，總分子量為29 285.25，理論等電點（pI）為6.58；帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為23，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為22. 不穩(wěn)定系數(shù)為25.30，脂肪系數(shù)為87.70，親水性系數(shù)為-0.161，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白.

2.3.2 PTA的跨膜區(qū)域預測

用TMHMM預測PTA的N-端第5～27 個氨基酸殘基位于跨膜區(qū)域（圖5），說明PTA屬于跨膜蛋白，推測PTA 可能定位于細胞膜上，屬于分泌蛋白.用WoLF PSORT 預測該蛋白亞細胞定位于細胞外，與TMHMM預測相一致.SignalP預測該蛋白質有信號肽的概率為99.700%，信號肽類型為SP（Sec/SPI），切割位點位于第24位丙氨酸A和第25為纈氨酸V殘基之間，信號肽序列為:MASKLLLFLLPAILGLVIPPAATA.

圖5 PTA跨膜區(qū)結構分析

2.3.3 PTA疏水性分析

通過Protscale 對PTA 的疏水性進行預測表明，多肽鏈第6 位的亮氨酸（Leu，L）具有最高分值2.98，第182位的賴氨酸（Lys，K）具有最低的分值-2.19. 已知氨基酸分值越低親水性越強，反之分值越高疏水性越強，可以得出在第182位的Lys親水性最強，第6位的Leu疏水性最強. 從圖6中可以看出，該蛋白質N-端部分氨基酸殘基和中間區(qū)域的部分氨基酸殘基是由一些疏水性氨基酸組成，其余區(qū)域主要由親水性氨基酸組成. 從整體看，其疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，所以推測其為親水性蛋白.

圖6 PTA疏水性分析

2.3.4 PTA結構域分析

NCBI在線分析PTA結構域，如圖7所示，該蛋白質包括2個B-lectin結構域，屬于B-lectin超家族，且包含3個甘露糖結合位點，見圖4中黑色下劃線標示序列. 由圖4可知，3個甘露糖結合位點的保守性不同，第1和第2個甘露糖結合位點保守性高，而第3個甘露糖結合位點氨基酸組成差異大，保守性低，說明不同半夏植株的凝集素仍存在一定差異.

圖7 PTA結構域

2.3.5 PTA二級結構及三維結構預測

用SOPMA在線預測PTA二級結構見圖8，PTA二級結構主要是無規(guī)則卷曲，占據(jù)45.72%的氨基酸殘基；其次是β-折疊，占據(jù)33.46%的氨基酸殘基；α-螺旋占據(jù)11.15%的氨基酸殘基；最少的是β-轉角，占據(jù)9.67%的氨基酸殘基. α-螺旋主要位于蛋白質的兩端，β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲散布在蛋白質中間.

圖8 PTA二級結構預測

通過SWISS-MODEL 在線比對，發(fā)現(xiàn)PTA 有2 個結構域，分別比對到氨基酸序列相似度都在80%以上的高度相似的模板，模板分別是Structure of Lectin fromColocasia esculenta（L.）Schott（SMTL ID：5j76.1）和Structure ofColocasia esculentaagglutinin（SMTL ID：5d5g.2），分別是芋的貯藏蛋白植物凝集素和芋塊莖凝集素. 以2個已知蛋白模型為基礎，預測PTA兩個結構域的3D結構見圖9，A是1～109個氨基酸形成結構域的3D結構，B是117～227個氨基酸形成結構域的3D結構.

圖9 PTA三維結構預測

2.3.6 PTA系統(tǒng)進化

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中選取12 條凝集素蛋白與PTA 進行相似性比較，構建系統(tǒng)進化樹（圖10）. 結果表明：本次克隆的宿半夏凝集素基因編碼的蛋白PTA 與其他6 種半夏凝集素AAR27794.1、ABX47148.1、AAU29612.1、AFY06641.1、QNL35375.1和AAP20876.1遺傳關系近，聚為一支，與海芋凝集素ABC69036.1的關系最遠. 說明半夏凝集素的進化關系與物種進化關系基本一致. 半夏凝集素與掌葉半夏凝集素AAR27793.1聚為一大支，與石蜘蛛凝集素AOA49622.1未聚在一起，還有一種半夏凝集素AEZ35184.1未與多種半夏凝集素聚合在一起.

圖10 利用NJ法構建植物凝集素間的進化樹

3 討論和結論

植物凝集素是一類分布廣泛的非免疫來源的糖結合蛋白，由于其具有顯著的生物活性而得到廣泛的研究和應用. 植物凝集素可以通過識別并結合動物、昆蟲腸胃及微生物表面特異性糖基，從而發(fā)揮促進有絲分裂、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌、殺蟲、抗病毒等活性［15］；也可以提高植物對環(huán)境的適應能力，如耐旱、耐鹽、耐熱性［16］；植物凝集素廣泛存在于植物的各種組織器官中，在根、莖、葉、花、果實中都能被檢測到，以種子和營養(yǎng)貯存器官（如塊莖、鱗莖、塊根）中最為豐富，參與植物的生長發(fā)育過程［17］.

半夏凝集素（Pinellia ternataagglutinin，PTA）是一種典型的具有甘露糖結合位點的植物凝集素［4］，屬于雪花蓮家族（GNA）的凝集素［18］. 半夏蛋白具有很多生理功能，其中半夏凝集素是半夏蛋白發(fā)揮其生理功能的重要成分之一. 盡管對不同產地的半夏凝集素開展一定的研究［4，13，18-19］，但是由于半夏的高度遺傳多樣性，不同半夏之間遺傳物質有一定的差異［20］. 宿半夏的凝集素至今未見報道，本研究克隆宿半夏的凝集素基因，為宿半夏凝集素的應用及優(yōu)良品種選育提供參考.

本試驗成功克隆半夏塊莖中的凝集素基因，其開放閱讀框長度為810 bp，編碼269個氨基酸，分子量為29 285.25，等電點為6.58，具有典型的跨膜結構域，屬于跨膜親水蛋白，預測定位于細胞膜，與趙歡等［18］研究結果PTA亞細胞定位于細胞膜上相一致. 多序列比對結果顯示該蛋白與其他6種半夏植物凝集素氨基酸序列具有高度的相似性，相似度達97.82%，說明不同半夏植株的凝集素序列具有高度的保守性，該結果與趙歡［18］的研究結果一致. 不同產地、不同生境下，不同半夏植株的半夏凝集素也存在一定差異，尤其第3個甘露糖結合位點存在較大差別，該結果與張正英［13］研究結果一致，同樣也說明半夏的遺傳多樣性.

通過比對，本次克隆的宿半夏PTA與趙歡等［18］克隆的半夏凝集素蛋白序列（AGV40777.1）完全一致，趙歡所用材料是川半夏的主產區(qū)四川省南充市的野生半夏葉片DNA，本研究用的材料是安徽省淮北市道地藥材宿半夏塊莖RNA，兩半夏材料生境差別大，川半夏基因組的半夏凝集素和宿半夏塊莖中表達的半夏凝集素的氨基酸序列完全相同，那么2種半夏塊莖中凝集素的含量是否相同，其他藥效成分含量是否相近，2種半夏能否互相替代，還有待于進一步深入研究. 系統(tǒng)進化樹分析表明，大部分半夏凝集素聚合在一起，唯有半夏凝集素AEZ35184.1游離在外，分析發(fā)現(xiàn)半夏凝集素AEZ35184.1是由257個氨基酸組成，與半夏PTA 的一致性為91.88%. 而趙歡等［21］認為半夏凝集素PTA 的氨基酸序列長度為268-269aa，半夏凝集素AEZ35184.1還有待于進一步分析.