不同劑型苯甲酸在體外和體內(nèi)的控釋效果研究

趙曉南，胡友軍，程皇座，劉 堅(jiān)，陸信芳，李海蕓

（廣東酸動(dòng)力生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

苯甲酸作為酸化劑，在動(dòng)物飼糧中適量添加，能有效提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、維持腸道微生態(tài)平衡，從而保障畜禽健康［1-2］。 但添加苯甲酸常規(guī)劑型時(shí)，其可快速進(jìn)入血液，引起血糖升高，產(chǎn)生飽腹感，從而降低采食量［3］。 此外，分子態(tài)苯甲酸雖具有良好的抑菌能力， 但在胃腸道生理環(huán)境下會(huì)迅速離子化［4］，失去抑菌能力，不能有效到達(dá)腸道中后段的菌群富集處發(fā)揮功效，因此，在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)上常通過(guò)劑量效應(yīng)來(lái)達(dá)到抑制有害菌繁殖和促生長(zhǎng)的效果［5］。 通過(guò)包被控釋工藝處理，使苯甲酸分子安全過(guò)胃，且避免在腸道前段大量離子化，實(shí)現(xiàn)其在全腸道的長(zhǎng)效抑菌功效， 是經(jīng)濟(jì)有效的使用途徑。 該試驗(yàn)通過(guò)體外溶出試驗(yàn)和體內(nèi)控釋試驗(yàn)， 比較研究普通型與控釋型2 種劑型苯甲酸的控釋效果， 為控釋型苯甲酸在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)上的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 苯甲酸及相關(guān)試劑

普通型苯甲酸為市售產(chǎn)品， 苯甲酸含量≥99%； 控釋型苯甲酸由廣東酸動(dòng)力生物科技有限公司生產(chǎn)，苯甲酸含量≥40%。 0.1%普通型苯甲酸的面粉丸劑、 含0.1%控釋型苯甲酸的面粉丸劑，制作方法：取少量干面粉，加微量水，攪拌后搓成細(xì)條， 分成微小的丸劑， 提前1 d 測(cè)算雞的采食量， 按0.1%比例稱取普通型和控釋型苯甲酸，均勻黏附在上述丸劑，即得。 對(duì)照品苯甲酸，純度≥99%，購(gòu)自阿拉丁試劑公司。 甲醇為色譜純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司； 其余試劑為分析純，水為超純水。

1.1.2 人工胃液和人工腸液

人工胃液和人工腸液參照 《中國(guó)藥典》2015版配制。人工胃液制備方法：取濃鹽酸23.4 mL，用水定容至100 mL 配制成稀鹽酸， 取上述稀鹽酸16.4 mL，加水500 mL 與10 g 胃蛋白酶混勻，攪拌均勻，加水稀釋定容至1 000 mL，調(diào)pH 值至3.5；人工腸液制備方法：取6.8 g 磷酸二氫鉀，加500 mL水溶解，與10 g 胰蛋白酶混勻，加水稀釋定容至1 000 mL，調(diào)pH 值至6.8。

1.1.3 主要儀器

Agilent-1260 高效液相色譜儀， 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器有限公司產(chǎn)品；RC806D 溶出度儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

體重相近、健康的60 日齡清遠(yuǎn)麻肉雞36 只，購(gòu)自廣東省佛山新廣農(nóng)牧有限公司。 試驗(yàn)在廣東酸動(dòng)力創(chuàng)新中心動(dòng)物試驗(yàn)基地進(jìn)行。預(yù)飼期間，試驗(yàn)雞自由采食和飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外溶出試驗(yàn)

1.2.1.1 體外試驗(yàn)苯甲酸含量測(cè)定方法

①溶出度儀參數(shù)設(shè)置：開(kāi)啟溶出度儀，將控溫設(shè)置為39.0 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為100 r/min，調(diào)整溶出度儀的取樣參數(shù)分別為1、2 h（人工胃液）和1、2、3、4 h（人工腸液）。

②啟動(dòng)溶出度儀升溫系統(tǒng)，待水溫達(dá)到39 ℃時(shí)， 分別稱取普通型苯甲酸和控釋型苯甲酸樣品各1 g（精確至0.000 1 g）于200 目轉(zhuǎn)籃中，置于對(duì)應(yīng)的溶出杯中，各加入500 mL 的人工胃液或人工腸液，啟動(dòng)溶出度儀攪拌系統(tǒng)，開(kāi)始計(jì)時(shí)。

③在試驗(yàn)設(shè)定的各時(shí)間點(diǎn)， 分別吸取對(duì)應(yīng)樣液5 mL，過(guò)濾，并置于對(duì)應(yīng)的具塞比色管中。

④從對(duì)應(yīng)的比色管中分別吸取1 mL 樣液于對(duì)應(yīng)的10 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容至刻度搖勻，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016），應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)檢測(cè)苯甲酸含量。

1.2.1.2 指標(biāo)計(jì)算方法

溶出度（%）=人工胃液或人工腸液中的苯甲酸含量/樣品中測(cè)定的苯甲酸含量×100。

留存率（%）=100-溶出度。

1.2.2 體內(nèi)控釋試驗(yàn)

1.2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將36 只清遠(yuǎn)麻肉雞隨機(jī)分為3 組， 每組12只。 用不含苯甲酸的空白飼糧預(yù)飼7 d，第8 天晨飼后立即分別投喂純面粉丸劑 （對(duì)照組）、含0.1%普通型苯甲酸的面粉丸劑 （普通型苯甲酸組）、含0.1%控釋型苯甲酸的面粉丸劑（控釋型苯甲酸組），在投喂后0、1、2、4 h 時(shí)，麻醉、屠宰肉雞并取樣。

1.2.2.2 樣品采集與處理

在投喂后0、1、2、4 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組屠宰3 只雞，迅速取腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸內(nèi)容物，分裝于滅菌EP 管中，-20 ℃保存，待測(cè)苯甲酸濃度。

1.2.2.3 胃腸內(nèi)容物苯甲酸含量測(cè)定方法

取內(nèi)容物樣品0.5 g 左右， 精確至0.000 1 g，用0.1 mol/L 稀鹽酸溶解， 超聲30 min 后， 用0.1 mol/L 稀鹽酸定容至50 mL，過(guò)濾，濾液經(jīng)高效液相色譜儀檢測(cè)，并采用外標(biāo)法，計(jì)算內(nèi)容物中苯甲酸濃度。

色譜條件：Agilent-1260 高效液相色譜儀；色譜 柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ （150 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-乙酸銨（5∶95），流速1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行初步整理。 體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析， 采用Duncan′s 法進(jìn)行組間多重比較；體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑型苯甲酸的體外控釋效果

2.1.1 不同劑型苯甲酸在人工胃液中的留存效果

由表1 可知，在人工胃液中1 h，控釋型苯甲酸的留存率即過(guò)胃率是普通型苯甲酸的3.45 倍；在人工胃液中2 h 時(shí)， 普通型苯甲酸的含量低于檢測(cè)下限，而控釋型苯甲酸的留存率為56.18%。

表1 不同劑型苯甲酸在人工胃液中的留存率 單位：%

2.1.2 不同劑型苯甲酸在人工腸液中的留存效果

由表2 可知，在人工腸液中1 h，普通型苯甲酸含量已低于檢測(cè)下限， 而控釋型苯甲酸的留存率為70.13%；至4 h 時(shí)，控釋型苯甲酸的留存率為40.10%。

表2 不同劑型苯甲酸在人工腸液中的留存率 單位：%

2.2 不同劑型苯甲酸的體內(nèi)控釋效果

2.2.1 采食后0 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中苯甲酸濃度

如表3 所示，采食后0 h，與對(duì)照組相比，不同劑型苯甲酸組在各區(qū)段胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 采食不同劑型苯甲酸后0 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度 單位：μg/g

2.2.2 采食后1 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中苯甲酸濃度

如表4 所示，采食后1 h，與對(duì)照組相比，采食普通型苯甲酸或控釋型苯甲酸顯著（P＜0.05）增加胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度（盲腸、結(jié)腸+直腸段除外）； 苯甲酸主要集中在胃部和十二指腸，以控釋型苯甲酸組在腺胃+肌胃中的苯甲酸濃度最高，是普通型苯甲酸組的5.46 倍，二者差異顯著（P＜0.05）。 這表明，采食后1 h，不同劑型苯甲酸可增加胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度， 控釋型苯甲酸效果優(yōu)于普通型苯甲酸。

表4 采食不同劑型苯甲酸后1 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度 單位：μg/g

2.2.3 采食后2 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中苯甲酸濃度

如表5 所示，采食后2 h，與對(duì)照組相比，采食普通型苯甲酸或控釋型苯甲酸依然顯著（P＜0.05）增加胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度（結(jié)腸+直腸段除外）；苯甲酸主要集中在小腸和盲腸段，其中，控釋型苯甲酸組在小腸后段（空腸、回腸）和盲腸內(nèi)容物中的苯甲酸濃度顯著（P＜0.05）高于普通型苯甲酸組，空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物中的苯甲酸濃度分別是普通型苯甲酸組的1.61、2.43、1.95倍。 這表明，采食后2 h，不同劑型苯甲酸均可過(guò)胃進(jìn)入腸道，控釋型苯甲酸過(guò)胃率高于普通型苯甲酸。

表5 采食不同劑型苯甲酸后2 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度 單位：μg/g

2.2.4 采食后4 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中苯甲酸濃度

如表6 所示，采食后4 h，與對(duì)照組相比，采食普通型苯甲酸或控釋型苯甲酸顯著（P＜0.05）增加腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度（盲腸、結(jié)腸+直腸段除外）； 普通型苯甲酸組主要在空腸和回腸段；控釋型苯甲酸組在小腸后段和大腸段均有大幅度提升， 且回腸內(nèi)容中的苯甲酸濃度是普通型苯甲酸組的6.68 倍，二者差異顯著（P＜0.05）。 這表明，采食后4 h， 控釋型苯甲酸仍能在小腸后段存留，緩慢釋放苯甲酸。

表6 采食不同劑型苯甲酸后4 h 肉雞胃腸道內(nèi)容物中的苯甲酸濃度 單位：μg/g

3 討論

苯甲酸具有廣譜且穩(wěn)定的抑菌能力， 廣泛應(yīng)用于食品防腐［6］。 同時(shí)，苯甲酸作為一種酸度調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于飼料養(yǎng)殖行業(yè)， 用于改善動(dòng)物腸道菌群和提高生產(chǎn)性能［7-8］。 研究表明，苯甲酸的良好抑菌能力取決于其特殊的抑菌機(jī)理， 即分子態(tài)苯甲酸自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜， 在細(xì)菌體內(nèi)弱堿性環(huán)境下迅速解離為酸根離子和氫離子， 擾亂細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響細(xì)菌正常代謝和繁殖，而細(xì)菌為調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)， 啟動(dòng)氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)泵將多余的氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)出體內(nèi)，這一過(guò)程需要耗能，最終導(dǎo)致細(xì)菌衰竭死亡，從而起到抑菌殺菌作用［9］。 但由于苯甲酸本身特殊的代謝和理化特性， 在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，其能夠快速吸收進(jìn)入血液引起血糖升高，并在動(dòng)物腸道生理環(huán)境下快速離子化而失去抑菌能力［3］。 故常規(guī)未處理或普通制劑處理的苯甲酸通常會(huì)在消化道前段離子化，發(fā)揮消化酸作用，能到達(dá)腸道尤其是腸道后段發(fā)揮抑菌作用的苯甲酸分子數(shù)量大大降低，不能有效發(fā)揮抑菌作用。 Silveira等［10］研究顯示，添加不同劑量苯甲酸使仔豬胃中pH 值均顯著降低， 而腸道中pH 值無(wú)顯著變化，充分證明了未經(jīng)處理的苯甲酸大部分在胃中被離子化。

分子態(tài)苯甲酸具有顯著抑菌能力， 通過(guò)路易斯酸堿電子理論可以得到解釋?zhuān)?這與苯甲酸分子和苯甲酸根離子電子云密度分布密切相關(guān)，因此，一直以來(lái)， 人們通過(guò)劑量效應(yīng)提高苯甲酸在腸道內(nèi)的分子留存率，從而達(dá)到抑菌促生長(zhǎng)效果。眾多研究表明， 在仔豬飼糧中至少添加5 kg/t 苯甲酸才具有抑菌效果［11-15］。 但這也極大地增加了動(dòng)物脾、肝、肺等內(nèi)臟功能損傷的風(fēng)險(xiǎn)和養(yǎng)殖成本［16-17］，甚至有抑制生長(zhǎng)的負(fù)面結(jié)果［18］，因此，國(guó)際上從2016 年就開(kāi)始了苯甲酸的制劑化探索和應(yīng)用，通過(guò)包被控釋處理的方式提高苯甲酸在胃腸道內(nèi)的分子留存率［19］，進(jìn)而減少添加量。 在該研究中，相較于普通型苯甲酸， 控釋型苯甲酸在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中均有較高的過(guò)胃率， 且能在腸道后段長(zhǎng)效控釋?zhuān)@與Yousaf 等［19］的研究結(jié)果一致。 這表明控釋型苯甲酸可實(shí)現(xiàn)在畜禽全腸道持續(xù)緩慢釋放，能夠以分子態(tài)發(fā)揮抑菌促生長(zhǎng)作用，最終實(shí)現(xiàn)低劑量添加、降本增效的目的。 Morel 等［20］在30～60 kg 生長(zhǎng)豬上開(kāi)展了2.1 kg 包被苯甲酸和5 kg普通苯甲酸的比較試驗(yàn)， 結(jié)果表明包被苯甲酸組日增重、采食量和料重比均有改善，這也說(shuō)明控釋型苯甲酸具有使用劑量低、 產(chǎn)出效果高的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

體外和體內(nèi)試驗(yàn)均表明， 與普通型苯甲酸相比， 經(jīng)包被等制劑化處理的控釋型苯甲酸能有效過(guò)胃并進(jìn)入腸道后段，在整個(gè)腸道緩慢釋放，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抑菌功效。