菌酶協(xié)同對(duì)里岔黑豬斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響

劉宗正，鄒 明，檀學(xué)進(jìn)，曹 瑞，肖 娜，宋修瑜，劉迎春

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；3.青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司，山東 青島 266114；4.青島派如環(huán)境科技有限公司，山東 青島 266200）

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告要求自2020 年1月1 日起， 退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種，標(biāo)志著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入飼料端“無(wú)抗、禁抗”的時(shí)代，這對(duì)飼料品質(zhì)的要求更加嚴(yán)格。近年來(lái)，飼料中添加菌制劑、酶制劑成為一種流行的趨勢(shì)，被認(rèn)為是替抗的優(yōu)先產(chǎn)品，在動(dòng)物生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中得到了廣泛應(yīng)用［1-2］。

里岔黑豬一般采用傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式， 較差的生活環(huán)境導(dǎo)致疾病頻發(fā)［3］。 為解決里岔黑豬健康養(yǎng)殖和飼喂的關(guān)鍵問題， 引入菌酶協(xié)同技術(shù)提高里岔黑豬的健康水平。過往的研究發(fā)現(xiàn)，酶的廣泛應(yīng)用，可以提高動(dòng)物的飼料消化水平，促進(jìn)動(dòng)物腸道健康， 提高動(dòng)物免疫水平， 提高動(dòng)物的抗病性，進(jìn)而提高生產(chǎn)性能［4-5］。 菌酶協(xié)同技術(shù)在使用過程中無(wú)毒副作用，成為畜牧業(yè)生態(tài)、綠色發(fā)展的保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的益生菌為購(gòu)自山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司的肽菌素727， 酶制劑為購(gòu)自建明（中國(guó)）科技有限公司的PS 酶；IgM 和IgG 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)在青島膠河源農(nóng)產(chǎn)有限公司里岔黑豬養(yǎng)殖基地進(jìn)行。 選取80 頭28 日齡體重為（6.72±0.12）kg 的健康里岔黑豬斷奶仔豬（公母仔豬各40頭），隨機(jī)分為對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、益生菌組（添加1‰的益生菌）、酶制劑組（添加1‰的酶制劑）、菌酶協(xié)同組（添加1‰的益生菌和1‰的酶制劑），每組20 頭。 試驗(yàn)期為35 d，預(yù)飼期為7 d，正飼期為28 d，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，其他組飼喂添加益生菌或酶制劑的日糧。 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。 試驗(yàn)期間保持各組舍內(nèi)溫濕度、采食飲水方式等飼養(yǎng)管理方法一致， 并跟蹤記錄各組里岔黑豬的生長(zhǎng)性能和健康情況。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)期間記錄各組仔豬的每日投料量和余料量，稱量試驗(yàn)初末的試驗(yàn)豬體重，并計(jì)算平均日增重（ADG）、平均采食量（ADFI）和料重比（F/G），計(jì)算公式如下：平均日增重=（試驗(yàn)?zāi)┲?試驗(yàn)初重）/飼養(yǎng)天數(shù)；平均采食量=（每日投料量之和-每日余料量之和）/總頭數(shù)；料重比=總耗料/總增重。

1.3.2 健康狀況測(cè)評(píng)

試驗(yàn)期間觀察并記錄試驗(yàn)豬的健康狀況，對(duì)于腹瀉豬只的情況，采用4 級(jí)評(píng)分法進(jìn)行判定。 0分為無(wú)腹瀉 （正常糞便），1 分為輕度腹瀉 （軟糞便），2 分為中度腹瀉（稀糞便），3 分為重度腹瀉（液體糞便）； 腹瀉指數(shù)=觀察記錄得分之和/總天數(shù)。

1.3.3 血清免疫指標(biāo)測(cè)定

在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)分別從各組中隨機(jī)選取6 頭健康狀況良好、 體重接近的仔豬進(jìn)行采血，共采集24 頭，血清保存于-20 ℃低溫冰箱。 按照試劑盒說(shuō)明書操作流程檢測(cè)血清中的IgM 和IgG 含量。

1.3.4 腸道菌群分析

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集新鮮糞便，每組采集6 頭，共采集24 頭，待豬排便后立即用無(wú)菌采樣器接住糞便，用無(wú)菌棉棒蘸取中間約5 g 的糞便，無(wú)菌取樣袋封存后立即投入液氮凍存。 樣品由派森諾生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA 高通量測(cè)序， 采用Illumina MiSeq 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端（paired-end）測(cè)序。 所獲數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析，得到腸道菌群組成及相對(duì)豐度數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）， 并利用Tukey′s法進(jìn)行多重比較，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同對(duì)里岔黑豬斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，與對(duì)照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組初重?zé)o顯著差異（P>0.05），末重有極顯著（P<0.01）差異。 平均日采食量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）提高。 平均日增重結(jié)果顯示，酶制劑組和菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）高于對(duì)照組；益生菌組與對(duì)照組無(wú)顯著（P>0.05）差異。 料重比結(jié)果顯示，酶制劑組、菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）低于對(duì)照組，益生菌組與對(duì)照組相比無(wú)顯著（P>0.05）差異。 益生菌組、 菌酶協(xié)同組腹瀉指數(shù)極顯著（P<0.01）降低，酶制劑組差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同菌酶條件下斷奶仔豬生長(zhǎng)性能指標(biāo)情況

2.2 菌酶協(xié)同對(duì)里岔黑豬斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表3 可知， 與對(duì)照組相比菌酶協(xié)同組極顯著（P＜0.01）提高了斷奶仔豬血清IgG、IgM 含量；與對(duì)照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組斷奶仔豬血清IgM 含量極顯著（P<0.01）增高。

表3 不同菌酶條件下斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)情況 單位：μg/mL

2.3 菌酶協(xié)同對(duì)里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群的影響

2.3.1 斷奶仔豬腸道菌群豐度等級(jí)曲線

由圖1 可知， 在不同處理組的斷奶仔豬腸道菌群豐度等級(jí)曲線中， 菌酶協(xié)同組的折線長(zhǎng)度最長(zhǎng)且折線平緩，說(shuō)明其群落組成的均勻度最高，物種分布最均勻。

圖1 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群豐度等級(jí)曲線

2.3.2 菌酶協(xié)同對(duì)斷奶仔豬腸道菌群Alpha 多樣性分析

由表4 可知， 各組樣品的測(cè)序覆蓋率（coverage）均超過了99%， 可真實(shí)反映各組樣品菌群的多樣性情況。 各組樣品經(jīng)Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組Chao1 指數(shù)顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組，說(shuō)明單獨(dú)使用酶制劑、菌制劑或者采用菌酶協(xié)同的飼喂方式均可顯著提高里岔黑豬斷奶仔豬的腸道菌群豐度； 但對(duì)Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無(wú)顯著（P＞0.05）影響。

表4 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群Alpha 多樣性 單位：%

2.3.3 菌酶協(xié)同對(duì)斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

斷奶仔豬腸道菌群門水平相對(duì)豐度大于0.1%的菌群前五位分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬 桿 菌 門 （Bacteroidetes）、 螺 旋 體 門（Spirochaetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），其中厚壁菌門是相對(duì)豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌門（見圖2）。 由表5 可知，與對(duì)照組相比，菌酶協(xié)同組和益生菌組顯著（P＜0.05）提高了斷奶仔豬腸道菌群擬桿菌門相對(duì)豐度。

圖2 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群門水平相對(duì)豐度

表5 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群門水平相對(duì)豐度 單位：%

3 討論

隨著非洲豬瘟疫情肆虐， 養(yǎng)殖企業(yè)越來(lái)越重視動(dòng)物保健，尤其是在飼料中禁止添加抗生素后，益生菌等其他飼料添加劑的使用， 成為了養(yǎng)殖業(yè)替抗方案的共識(shí)， 也成為了行業(yè)中研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)［6］。 菌酶協(xié)同技術(shù)在替代抗生素方面效果顯著，促進(jìn)了生豬養(yǎng)殖的健康發(fā)展。 張茂華等［7］研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同可有效提高育肥豬的平均日增重，張艷萍等［8］通過在飼糧中添加了益生菌等添加劑，使育肥豬的日增重提高了6.55%、料重比降低3.09%、腹瀉率降低54.39%，與傳統(tǒng)的飼喂方式相比，飼養(yǎng)效率進(jìn)一步提高。菌酶協(xié)同不僅應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖，孔令勇等［9］在櫻桃谷鴨的飼養(yǎng)中應(yīng)用，結(jié)果顯示櫻桃谷鴨日增重得到提高， 料重比和淘汰率明顯降低。在斷奶仔豬的應(yīng)用中，陳文輝等［10］研究結(jié)果證實(shí)，菌酶協(xié)同可顯著提高平均日增重，并降低單位增重飼料消耗量。 在研究菌酶協(xié)同應(yīng)用于提高飼料利用效率的同時(shí)， 許多研究也集中在其對(duì)畜禽生長(zhǎng)性能的影響。羅佳捷等［11］研究表明，菌酶協(xié)同在改善肥育豬生長(zhǎng)性能方面與抗生素作用接近。 該試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，菌酶協(xié)同提高了平均日增重， 降低了料重比和腹瀉率，表明菌酶協(xié)同飼喂里岔黑豬斷奶仔豬，使其生長(zhǎng)性能和健康狀況得到改善；并且酶制劑的應(yīng)用可提高飼料消化率，而益生菌的應(yīng)用則可以在腸道內(nèi)促進(jìn)腸絨毛的健康，進(jìn)一步提高飼料養(yǎng)分吸收、保持腸道菌群穩(wěn)定， 改善仔豬的生長(zhǎng)性能及健康狀況。

血清免疫球蛋白IgM 和IgG 水平是反映動(dòng)物機(jī)體免疫能力的重要指標(biāo)， 當(dāng)細(xì)菌或病毒入侵機(jī)體的時(shí)候，免疫球蛋白起到防御作用，是動(dòng)物機(jī)體重要的免疫組成部分。研究表明，小分子肽進(jìn)入機(jī)體后通過刺激機(jī)體分泌特異性酶， 從而引起免疫應(yīng)答， 使動(dòng)物血清中的免疫球蛋白含量維持在較高水平，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平［12-13］。Xu 等［14］通過飼喂抗菌肽研究其對(duì)健康仔豬和攻毒仔豬的影響， 結(jié)果表明抗菌肽顯著提高了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和機(jī)體免疫力， 血清中IgM 和IgG 含量明顯高于對(duì)照組。 Ma 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，酶解豆粕應(yīng)用于生豬飼喂試驗(yàn)中，血清IgM 和IgA 含量明顯提高，具有免疫力水平的作用。 該試驗(yàn)飼料中添加肽菌素及消化酶制劑可能產(chǎn)生較多肽類物質(zhì)， 使里岔黑豬斷奶仔豬的機(jī)體免疫水平得到提高。

腸道健康是影響動(dòng)物整體健康及生長(zhǎng)性能的重要因素， 而腸道菌群的狀況直接反映了動(dòng)物腸道健康情況［16］。 該研究通過對(duì)里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序， 分析了里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群變化情況， 結(jié)果表明菌酶協(xié)同使用可顯著提高斷奶仔豬腸道菌群的相對(duì)豐富度。 通過豐度等級(jí)曲線可知，菌酶協(xié)同組折線平緩，群落組成的均勻度越高，物種分布最均勻。單獨(dú)使用酶制劑、 菌制劑或者采用菌酶協(xié)同的飼喂方式均可顯著提高里岔黑豬斷奶仔豬的腸道菌群相對(duì)豐度， 厚壁菌門 （Firmicutes） 和擬桿菌門（Bacteroidetes） 為腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌。 與對(duì)照組相比， 益生菌組和菌酶協(xié)同組的擬桿菌門（Bacteroidetes）含量顯著增加，厚壁菌門與擬桿菌門共同維持著腸道菌群的平衡， 當(dāng)斷奶仔豬開始攝入飼料后，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致了擬桿菌門的增多， 而擬桿菌門則與飼料營(yíng)養(yǎng)代謝有直接關(guān)系；螺旋體門（Spirochaetes）在腸道菌群中含量排在第3 位，而螺旋體門與豬拉痢密切相關(guān)，在該研究中采用益生菌和菌酶協(xié)同處理的里岔黑豬腸道螺旋體門數(shù)量顯著降低， 對(duì)里岔黑豬腸道健康起到了積極作用， 但螺旋體門的出現(xiàn)說(shuō)明里岔黑豬飼養(yǎng)環(huán)境有待提高， 應(yīng)進(jìn)一步做好里岔黑豬的驅(qū)蟲等工作。在前十名的腸道菌群中，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria） 的出現(xiàn)可能與采用井水飲水時(shí)會(huì)出現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌有關(guān)， 而藍(lán)細(xì)菌過多則會(huì)出現(xiàn)里岔黑豬胃腸道出血等問題。綜上所述，菌酶協(xié)同能夠提高斷奶仔豬腸道菌群多樣性， 從而增強(qiáng)腸道屏障體系防御能力，保護(hù)仔豬斷奶時(shí)的腸道健康，提高斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)。

4 結(jié)論

菌酶協(xié)同飼喂模式可以提高里岔黑豬斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，降低腹瀉指數(shù)，具有提高斷奶仔豬免疫力， 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。