傳統(tǒng)發(fā)酵毛豆腐的研究進(jìn)展

◎ 張繼輝，趙丹丹

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，蕪湖生命與健康工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

毛豆腐是我國中部地區(qū)流行的豆類發(fā)酵食品，以皖南徽州地區(qū)生產(chǎn)的毛豆腐最具風(fēng)味，是一種由霉菌發(fā)酵而成并由白色真菌菌絲覆蓋的大豆蛋白豆腐，烹飪方法多樣，味道鮮美。毛豆腐的生產(chǎn)一般以手工家庭作坊式生產(chǎn)為主，通過霉菌發(fā)酵制備而成，由于其是在自然環(huán)境下發(fā)酵，參與發(fā)酵的微生物種類多樣，主要是毛霉。毛霉發(fā)酵制成的毛豆腐，提高了某些營養(yǎng)素的生物利用度，改變了豆腐的質(zhì)地和風(fēng)味。

1 毛豆腐加工工藝進(jìn)展

1.1 傳統(tǒng)加工工藝

徽州毛豆腐的傳統(tǒng)制作工藝是用含有大量環(huán)境微生物的天然發(fā)酵豆腐酸水進(jìn)行凝固，生產(chǎn)規(guī)模大部分以家庭作坊為主，如中國黃山市休寧縣的方鑫玉家庭作坊一百多年來一直使用天然發(fā)酵豆腐酸水凝結(jié)劑生產(chǎn)毛豆腐。具體工藝為大豆浸泡過后研磨過濾制成豆?jié){，然后加熱到80 ℃和天然發(fā)酵豆腐酸水 （pH ＜4.0）以1∶10的比例加入混凝。凝固后的豆?jié){靜置15 min，使其完全凝固，將上層豆腐黃水過濾，紗布包裹豆腐后用雙層磨具進(jìn)行壓片，最后切割后形成4 cm×4 cm×3 cm的豆腐磚。隨后，在豆腐磚上噴灑毛霉孢子懸浮液[1-2]，在20 ℃的培養(yǎng)箱中放置4 d，濕度保持在90%左右，空氣抽吸以確保通風(fēng)。

1.2 現(xiàn)代加工工藝

毛豆腐制作的傳統(tǒng)工藝一直以作坊式、經(jīng)驗式和發(fā)酵粗放式為主，受環(huán)境和人為因素影響大，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。有相關(guān)研究者檢測出傳統(tǒng)毛豆腐生產(chǎn)車間中菌落總數(shù)為4.5 lgCFU·m-3，雜菌污染會敗壞毛豆腐的品質(zhì)，還會引起有害物質(zhì)如生物胺的累積，直接影響毛豆腐的口感[3-7]。國內(nèi)對毛豆腐的現(xiàn)代加工工藝研究較少，部分學(xué)者從發(fā)酵條件和發(fā)酵菌種上進(jìn)行了現(xiàn)代加工工藝的研究。

李然等[8]通過正交優(yōu)化的方法探究了毛豆腐達(dá)到最佳食用品質(zhì)時所需的發(fā)酵條件，結(jié)果顯示發(fā)酵時間4 d、 發(fā)酵溫度25 ℃、刷鹽液濃度2%為最佳發(fā)酵條件，將刷鹽液濃度為2%的豆腐胚在20 ℃的條件下培養(yǎng)4 d， 毛豆腐氨基酸態(tài)氮的含量隨著發(fā)酵時間的延長不斷增多。李婷婷[9]將毛霉菌LMM1和副干酪乳桿菌LMX1按1∶1的比例人工強化接種于豆腐胚表面，在15 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d可以得到發(fā)酵性狀良好的毛豆腐。

2 毛豆腐制作過程中微生物菌群落結(jié)構(gòu)研究

目前，關(guān)于毛豆腐的微生物學(xué)研究還不充分，但國內(nèi)學(xué)者通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法、16s DNA測序以及宏基因組測序等方法對毛豆腐及制作過程中的微生物進(jìn)行了鑒定、分離和研究。ZHAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)毛霉是毛豆腐的主要發(fā)酵劑，毛豆腐的發(fā)酵受原料和環(huán)境因素的影響，包括溫度、濕度、發(fā)酵時間和加工條件等。

王磊等[11]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從云南毛豆腐中分離得到總狀毛霉、無根根霉、黃曲霉、白地霉和常見青霉，其中毛豆腐中的優(yōu)勢菌為無根根霉和總狀毛霉。李婷婷[9]從傳統(tǒng)徽州毛豆腐中分離篩選出一株產(chǎn)蛋白酶高大毛霉菌LMM1（Mucor mucedostrain LMM1 ）和一株產(chǎn)蛋白酶副干酪乳桿菌LMX1（Lactobacillus paracaseistrain LMX1），并按1∶1的比例人工強化接種于豆腐胚表面，在15 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d得到了發(fā)酵性狀良好的毛豆腐。YAN等[1]利用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)鑒定了來源于毛豆腐傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的天然發(fā)酵酸水中的細(xì)菌。結(jié)果表明，厄爾納拉乳桿菌（Lactobacillus ultunensis）、金腸球菌（Enterococcusbulliens）、格氏乳桿菌（Lactobacillus graminis）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳桿菌亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis）和黏膜乳桿菌（Lactobacillus mucosae）是毛豆腐發(fā)酵的主要細(xì)菌。同時采用培養(yǎng)法從天然發(fā)酵酸水中分離出6種乳酸菌，并分析其產(chǎn)酸能力，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌的乳酸含量最高，模擬混凝進(jìn)一步證實德氏乳桿菌生產(chǎn)的豆腐磚質(zhì)量最好，表明德氏乳桿菌可能是徽州毛豆腐傳統(tǒng)生產(chǎn)過程中合成風(fēng)味化合物的核心功能微生物。

BENUCCI等[12]采用高通量測序法對云南4個菜市場毛豆腐的真菌和細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該地區(qū)毛豆腐大約由170個真菌和365個細(xì)菌類群組成，不同市場的微生物類群不同。真菌主要由子囊菌屬（Ascomycota）、擔(dān)子菌屬（Basidiomycota）和毛菌屬（Mucoromycota）組成，其中毛霉菌尤為豐富，也與之前的研究結(jié)論相符合。毛霉菌通過蛋白質(zhì)水解過程和營養(yǎng)物質(zhì)的釋放影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量[10-13]。細(xì)菌群落以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）為主。在所有類群中，幾乎所有樣本中都存在屬于乳酸菌的乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc），這些細(xì)菌在發(fā)酵食品中普遍存在，并已報道在大豆發(fā)酵產(chǎn)品中存在，且具有抗菌和抗氧化特性、清除自由基和產(chǎn)生活性肽的功能[14-15]。

3 毛豆腐發(fā)酵的主要影響因素

3.1 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度是毛豆腐發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素，微生物的生長也受溫度的直接控制，同時微生物所釋放的蛋白酶類催化活性也與溫度密切相關(guān)。豆腐蛋白在發(fā)酵過程中被微生物酶水解為低分子量的多肽，這些化合物具有生物活性[16]。此外，部分多肽及其釋放的氨還能轉(zhuǎn)化為酸、醇等多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，直接決定了毛豆腐的風(fēng)味和品質(zhì)[17]。然而，自然發(fā)酵的毛豆腐由于溫度難以控制，導(dǎo)致成品質(zhì)量參差不齊，風(fēng)味不一。李然等[8]通過正交試驗對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出20 ℃下發(fā)酵的毛豆腐感官評分最高，這也與休寧方鑫玉家庭作坊傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的發(fā)酵溫度一致[1]。李婷婷等[9]將高大毛霉菌LMM1與副干酪乳桿菌LMX1以1∶1比例混菌接種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為15 ℃時培養(yǎng)的毛豆腐綜合評分最高。以上研究均為毛豆腐發(fā)酵溫度的確定提供了技術(shù)參考。

3.2 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間決定了毛豆腐的發(fā)酵程度。發(fā)酵時間較短，豆腐蛋白未能及時被微生物釋放的蛋白酶分解，風(fēng)味物質(zhì)釋放不充分，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，成品沒有發(fā)酵過后的醇香；發(fā)酵時間過長則會導(dǎo)致成品過熟，從而發(fā)生腐敗，影響成品質(zhì)量。毛豆腐傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的發(fā)酵時間一般為3～7 d，具體根據(jù)發(fā)酵溫度和菌絲生長情況而定。李然等[8]通過正交試驗得出最佳發(fā)酵時間為4 d，與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝發(fā)酵時間一致[1]。李婷婷等[9]使用混菌接種發(fā)酵得出最佳發(fā)酵時間為3 d，時間縮短可能與接種菌劑有直接關(guān)系。

4 毛豆腐發(fā)酵過程中理化指標(biāo)分析

4.1 毛豆腐的質(zhì)地變化

在毛豆腐發(fā)酵過程中其質(zhì)地會發(fā)生明顯的變化。ZHAO等[10]對毛豆腐質(zhì)地特征分析的結(jié)果表明，隨著發(fā)酵過程的延長，毛豆腐的黏附性呈增加趨勢，硬度、內(nèi)聚性和彈性呈降低趨勢。毛豆腐發(fā)酵過程中水分流失導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度增加，黏附性增加。隨著發(fā)酵時間的延長，大豆蛋白被毛霉菌分泌的蛋白酶降解為低分子量的蛋白片段，破壞了蛋白質(zhì)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致毛豆腐硬度的降低。內(nèi)聚性是描述刺激構(gòu)成產(chǎn)品主體的內(nèi)部鍵強度所需的力的參數(shù)，由于發(fā)酵過程中發(fā)生了蛋白質(zhì)水解，構(gòu)成蛋白質(zhì)基質(zhì)的鍵的數(shù)量和強度被破壞，因此發(fā)酵毛豆腐的內(nèi)聚性明顯低于未發(fā)酵的豆腐[18]。毛豆腐彈性的降低可能與水分的降低也有直接關(guān)系，這是因為水是一種增塑劑，彈性可能會隨著水分的減少而降低[19]。

4.2 毛豆腐的營養(yǎng)成分

豆制品本身的營養(yǎng)成分十分豐富，含有40%左右的蛋白質(zhì)、18%的脂肪、25%的碳水化合物、5%的礦物質(zhì)以及豐富的B族維生素等[20]。發(fā)酵以后豆制品中的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類以及碳水化合物在酶的作用下水解為肽、氨基酸、脂肪酸和單糖等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)是形成發(fā)酵豆制品特殊風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)[21]。

水溶性蛋白質(zhì)和氨基氮是黃山毛豆腐的主要營養(yǎng)成分。YAN等[1]研究發(fā)現(xiàn)隨著真菌在發(fā)酵過程中的生長代謝，蛋白酶水平逐漸升高，蛋白質(zhì)被降解為蛋白胨、多肽、氨基酸等微生物生長的中間體。因此，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，可溶性蛋白的總體含量逐漸增加。同樣，在發(fā)酵過程中，由于真菌蛋白酶介導(dǎo)水解豆腐蛋白，導(dǎo)致氨基酸氮含量增加。毛豆腐作為一種典型的發(fā)酵大豆產(chǎn)品具有更強的抗氧化和抗腫瘤特性[22]。有研究也報道了發(fā)酵豆制品除了具有免疫功能外，還對高血壓、糖尿病和炎癥也有顯著的治療作用[23]。毛豆腐的鮮味濃郁主要是因為它含有谷氨酸等多種氨基酸，氨基氮含量的增加對毛豆腐風(fēng)味的改善起到了關(guān)鍵作用。

此外，YAN等[1]還發(fā)現(xiàn)毛豆腐的還原糖含量在發(fā)酵過程中先增加后降低，最初的增加可能是由于豆腐淀粉被淀粉酶水解，隨著真菌的增殖，還原糖成為碳和能量的主要來源。同時，還原糖還參與了谷氨酸等氨基酸的生成，導(dǎo)致其在發(fā)酵2 d后含量下降。大豆總碳水化合物含量約為25%～30%，主要包括淀粉、低聚糖和膳食纖維，其中低聚糖占總碳水化合物的10%。大豆低聚糖的主要糖類是棉子糖和蔗糖，不能被人體直接消化吸收[24]。然而，真菌生長過程中所釋放的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和α-半乳糖苷酶等，最終會將多糖分解為糊精和低聚糖，再進(jìn)一步分解為葡萄糖和其他易被利用的糖，從而大大提高了毛豆腐中多糖的利用率。

發(fā)酵微生物在代謝過程中產(chǎn)生的脂肪酶將大豆中的脂類物質(zhì)逐級降解為小分子的酯、脂肪酸和醇類物質(zhì)。毛豆腐也不例外，在發(fā)酵的過程中一部分脂肪酸在其他酶類的協(xié)同作用下進(jìn)一步分解為小分子的揮發(fā)性醛、酸或醇類物質(zhì)，另一部分脂肪酸和醇類結(jié)合形成芳香族化合物，賦予毛豆腐特有的香氣[25]。

4.3 毛豆腐的揮發(fā)性成分

毛豆腐因其獨特的發(fā)酵工藝而具有特殊的風(fēng)味，揮發(fā)性物質(zhì)是毛豆腐發(fā)酵過程中的主要風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)是由發(fā)酵過程中各種酶促反應(yīng)產(chǎn)生的[26]。YAN等[1]在黃山毛豆腐中鑒定和定量了44種揮發(fā)性化合物，包括9種酯、9種酸、8種醇、5種醛、4種烯烴、3種酮、2種苯、2種酚、1種呋喃和1種吲哚。樣品毛豆腐揮發(fā)性化合物總量為3.156～16.016 μg·g-1， 發(fā)酵過程中所有樣品的主要化合物為醇和酸，這些化合物大部分在其他發(fā)酵食品如醬油、大醬和韓國大醬中均有報道[27-29]。其中，酸性物質(zhì)對黃山毛豆腐的風(fēng)味有重要影響。有研究表明發(fā)酵培養(yǎng)基中有機酸的存在抑制了污染細(xì)菌的生長，增加了發(fā)酵產(chǎn)品的醇厚、回味和風(fēng)味[30]。而毛豆腐中的醇以1-辛烯-3-醇、苯乙醇和庚醇最為常見，其中1-辛烯-3-醇含量尤其豐富。1-辛烯-3-醇是真菌中普遍存在的揮發(fā)性化合物，其也存在于豆科植物中[31-32]，有研究者從米酒、小麥曲和清酒曲中也分離得到了1-辛烯-3-醇[33]。

毛豆腐中還含有醛類、酮類和酚類等揮發(fā)性物質(zhì)。其中，苯甲醛是黃山毛豆腐中最重要的一種醛，它賦予毛豆腐苦杏仁的香氣。苯甲醛的形成是苯甲醇氧化的結(jié)果，或是芳香族氨基酸（如苯基羥基苯甲酸和對乙酸）的微生物分解的結(jié)果。毛豆腐中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)有愈創(chuàng)木酚和苯酚，愈創(chuàng)木酚賦予發(fā)酵豆腐辛辣和煙熏的香氣，該物質(zhì)主要通過對香豆酸和阿魏酸的酶促或熱脫羧形成的[34]。

5 結(jié)語

目前，徽州毛豆腐依然以手工作坊的生產(chǎn)方式為主，發(fā)酵條件靠經(jīng)驗把控，發(fā)酵技術(shù)靠代代相傳，沒有形成具體的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量不一，經(jīng)不起考量。自然發(fā)酵受環(huán)境影響巨大，環(huán)境中微生物種類復(fù)雜多樣，接種時具有不確定性和不穩(wěn)定性，直接影響毛豆腐的品質(zhì)。同時手工生產(chǎn)限制了毛豆腐的擴(kuò)大生產(chǎn)和銷售，直接阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，應(yīng)繼續(xù)加大對毛豆腐發(fā)酵過程中微生物群落多樣性的研究，篩選出有益發(fā)酵菌種，進(jìn)行定向接種發(fā)酵，控制產(chǎn)品品質(zhì)。生產(chǎn)方式應(yīng)逐漸從家庭作坊式向機械化方向發(fā)展，采用手工作坊和機械化相結(jié)合的生產(chǎn)方式，既能保留手工作坊式生產(chǎn)的特殊風(fēng)味，又能增產(chǎn)增量，擴(kuò)大市場。此外，還應(yīng)調(diào)整毛豆腐產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)，加強毛豆腐的豆腐胚制作、發(fā)酵、銷售等環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化，打造毛豆腐的特色效益等是現(xiàn)階段對毛豆腐家庭作坊及企業(yè)的重大考驗，也將直接影響整個產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。