膀胱癌患者來源的異種移植物模型構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展

李楊東，范毛川，竇啟鋒

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別占全部新發(fā)癌癥的 3.0%和2.1%[1-2]。近年來，膀胱癌的臨床治療主要采用部分或全膀胱切除術(shù)輔以常規(guī)放化療，但該治療方案的預(yù)后較差，常伴有多種不良反應(yīng)。隨著膀胱癌相關(guān)研究的不斷深入，細(xì)胞系衍生的異種移植物模型提高了人們對癌癥進(jìn)展和藥物治療作用機(jī)制的認(rèn)知，但此類異種移植物模型缺乏原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性。人源性異種移植物(patient-derived tumor xenograft，PDX)模型不僅保留了與原始腫瘤相似的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分子特征，還被廣泛認(rèn)為是比標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系更加具有生理相關(guān)性的臨床前模型[3]，能準(zhǔn)確預(yù)測化學(xué)治療藥物的臨床反應(yīng)，再現(xiàn)人類腫瘤的異質(zhì)性，因此，學(xué)者對腫瘤研究中PDX模型的開發(fā)和應(yīng)用越來越感興趣。針對PDX模型的研究有望應(yīng)用于指導(dǎo)腫瘤患者的個性化治療，以改善患者的生存質(zhì)量。本文就既往關(guān)于PDX模型構(gòu)建時小鼠種類、移植部位及方式的相關(guān)研究報道進(jìn)行綜述，旨在總結(jié)不同構(gòu)建方式的差異，為其應(yīng)用于膀胱癌治療的研究提供參考。

1 膀胱癌PDX模型的構(gòu)建

1.1 構(gòu)建膀胱癌PDX模型所用的移植物樣本的獲取方式制備異種移植物模型所用的患者腫瘤組織主要來源于手術(shù)切除的病理組織，在目前廣泛采用的PDX模型的構(gòu)建中，其前期準(zhǔn)備一般采用2種方法：一是將腫瘤組織切割成1～5 mm3大小不等的碎塊置于含有青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)[4-7]，二是將腫瘤組織裂解為單個細(xì)胞懸浮液后用基質(zhì)凝膠進(jìn)行培養(yǎng)[8]。這2種方法均有效提高了異種移植的成功率。除此之外，也有研究通過細(xì)針穿刺活檢的方式獲取患者來源的腫瘤組織，用于構(gòu)建PDX模型[9-10]；但與傳統(tǒng)的移植物提取方式相比，這種通過活檢樣本建立PDX模型的成功率較低，因此，該方式很少用于膀胱癌患者腫瘤組織的提取。

1.2 膀胱癌PDX模型構(gòu)建中免疫缺陷小鼠的選擇近年來，通常選用缺乏完整免疫系統(tǒng)(即體內(nèi)缺乏功能性T、B淋巴細(xì)胞)的小鼠來構(gòu)建PDX模型，此類小鼠能夠避免異種移植的腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，故而成為了癌癥研究中常用動物模型的選擇之一[11-12]。有研究證實，將患者來源的腫瘤組織植入免疫缺陷小鼠皮下而構(gòu)建的PDX模型比腫瘤細(xì)胞系模型能更準(zhǔn)確地反映原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特性[13]。一些團(tuán)隊基于免疫缺陷小鼠的特殊性，成功構(gòu)建了包括非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等在內(nèi)的多種類型的PDX模型[14-17]，這些模型中的腫瘤組織具有與原發(fā)腫瘤相似的主要組織學(xué)和遺傳學(xué)特征[18]，在一定程度上保留了原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性。

目前，構(gòu)建PDX模型所用的小鼠種類較多，采用不同小鼠所形成的PDX模型的移植成功率存在差異。一項系統(tǒng)性研究顯示，在制備PDX模型的研究中，異種移植成功率由低到高的免疫缺陷小鼠依次為無胸腺裸鼠、重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠和重度免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，NOG)小鼠[19]。NOD/SCID小鼠是SCID 小鼠與非肥胖糖尿病小鼠品系回交的免疫缺陷鼠，其不僅具有SCID 小鼠的特征，如缺乏功能性T 細(xì)胞和B 細(xì)胞，還具有非肥胖糖尿病小鼠的多種固有免疫缺陷的特點[20]。白細(xì)胞介素-2受體γ鏈(interleukin-2 receptor γ chain，IL-2Rγ)基因缺乏的NOD/SCID 小鼠又被稱為嚴(yán)重免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtml/Bcgen，NSG)小鼠，是在NOD/SCID 小鼠基礎(chǔ)上敲除IL-2Rγ基因，從而使其缺失成熟T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷(natural killer,NK) 細(xì)胞，其免疫缺陷最嚴(yán)重，是異種移植、人源化小鼠、免疫重建的重要載體[21-22]。NOG 小鼠缺乏成熟的T、B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞，補(bǔ)體活性減少，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能紊亂[23]。與NOD/SCID 小鼠相比，NOG小鼠的人體細(xì)胞和組織移植存活率顯著提高，可成為人類免疫細(xì)胞移植的理想模型。雖然，關(guān)于構(gòu)建PDX模型選用何種小鼠尚無統(tǒng)一明確的觀點，但其共同點均為免疫缺陷小鼠。

1.3 腫瘤移植部位的選擇目前的研究中最常見的腫瘤移植部位有原位移植和皮下移植，但不同移植部位對異種移植物的生長會有所影響。原位移植是將人類腫瘤組織接種到與腫瘤原發(fā)部位相對應(yīng)的移植宿主的組織器官內(nèi)，使其獲得與人體腫瘤相似的微環(huán)境。該移植方式高度還原了腫瘤細(xì)胞及其周圍間質(zhì)之間組織微環(huán)境的相互作用及腫瘤生長情況。PAN等[24]將從患者身上所獲取的膀胱腫瘤組織裂解為單細(xì)胞懸液，并植入NSG 小鼠的膀胱內(nèi)，建立了膀胱癌原位PDX模型。但這種移植技術(shù)難度系數(shù)較高，不易于操作。相比而言，皮下移植瘤模型操作簡單，成瘤率高，并能方便、實時檢測腫瘤的生長情況和評估藥物治療效果。皮下移植為最常見的異種移植部位，通常于小鼠的腎包膜下或雙側(cè)腎囊以及小鼠側(cè)腹部移植腫瘤組織并能連續(xù)傳代[25-27]。在腎包膜下接種患者腫瘤組織也被證實是最可靠的移植部位，這可能與移植部位的血液供應(yīng)豐富、新血管快速生成有關(guān)。盡管腎囊并不是膀胱癌的生理初始位置，但卻是PDX 模型存活和生長的最佳移植部位。有學(xué)者在小鼠雙側(cè)腎囊下注射患者膀胱腫瘤組織后，成功構(gòu)建了PDX 模型[25]。總體而言，原位移植和皮下移植存在互補(bǔ)關(guān)系，前者能評估腫瘤微環(huán)境中的特異性，而后者有利于研究上皮-基質(zhì)相互作用在腫瘤生長中的意義。因此，尚無研究明確表示PDX 模型的最佳移植部位。

2 PDX模型在膀胱癌研究中的應(yīng)用

膀胱癌是最常見的癌癥之一，其具有高復(fù)發(fā)率及高進(jìn)展率等特點。近年來，膀胱癌的發(fā)病率和病死率呈逐漸上升趨勢，成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病[28]。雖然新的膀胱癌治療方法不斷涌現(xiàn)，但其治療研究進(jìn)展受到體內(nèi)外實驗條件的限制。動物腫瘤模型是研究癌癥進(jìn)展的有效工具。PDX 模型是目前最常用的癌癥治療研究的體內(nèi)模型之一[29]，該模型不僅能很好地保留患者腫瘤的生物學(xué)特征，還再現(xiàn)了腫瘤異質(zhì)性[30]。20世紀(jì)70年代，WELDON等[31]首次建立了將癌細(xì)胞遞送到膀胱腔內(nèi)的動物模型構(gòu)建方法，目前此方法已廣泛應(yīng)用于膀胱癌治療領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。有研究使用細(xì)胞解離劑將培養(yǎng)為球體的膀胱癌患者來源的癌癥細(xì)胞(patient-derived cancer cell，PDC)分解為單個懸浮細(xì)胞，并將其注射到免疫缺陷雄性NOG小鼠的腹側(cè)皮下而成功建立了PDX 模型；蘇木精-伊紅染色顯示，由PDC衍生的異種移植腫瘤能表現(xiàn)出與原發(fā)腫瘤相似的形態(tài)特征[32]，有望成為研究膀胱癌致瘤性和耐藥性的重要載體，并有利于未來傳統(tǒng)腫瘤治療模式向精準(zhǔn)化、個體化的發(fā)展。目前，PDX模型被用于腫瘤患者的臨床前藥物評估、生物標(biāo)志物識別以及個性化藥物研發(fā)，以預(yù)測腫瘤患者的臨床治療效果[33]。目前，有學(xué)者在基于膀胱癌PDX 模型的應(yīng)用條件下，采用噻唑藍(lán)比色法篩選出了治療膀胱癌的藥物組合[24]。另外，有研究表明，按照臨床劑量的聯(lián)合用藥方式能有效減緩膀胱癌PDX模型的生長[34]，這可能對一些膀胱癌患者的治療研究有益。也有研究表明，在鑒別高危膀胱癌及發(fā)現(xiàn)膀胱癌生物標(biāo)志物方面，PDX模型都發(fā)揮著重要作用[35]。這些發(fā)現(xiàn)為膀胱癌患者治療方案的選擇提供了參考依據(jù)。另外，相應(yīng)的PDX模型臨床前試驗結(jié)果已經(jīng)被證實與腫瘤患者的相關(guān)研究結(jié)果一致[36-37]，這進(jìn)一步表明了該模型能很好地概括人類腫瘤的組織學(xué)特點、分子特征和腫瘤異質(zhì)性，為腫瘤精準(zhǔn)治療的發(fā)展提供了相關(guān)依據(jù)，為優(yōu)化膀胱癌患者的個性化治療提供了研究方向。

3 PDX模型的優(yōu)勢和不足

近年來，動物模型被廣泛用于癌癥研究，如由癌細(xì)胞系和基因工程小鼠模型開發(fā)的小鼠異種移植模型。盡管這些模型對癌癥研究做出了巨大貢獻(xiàn)，但在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，它們未能滿足不同患者的特定需求。PDX 模型在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面具有一定的獨特優(yōu)勢，這是其他癌癥模型無法比擬的。PDX模型的基本特征主要包含每個異種移植物都來自于隨機(jī)選擇的臨床患者的腫瘤組織，與其供體組織具有相同的遺傳背景，更利于將該模型應(yīng)用于藥物暴露研究，為不同患者提供特定需求及治療。有學(xué)者認(rèn)為,若是利用PDX模型進(jìn)一步明確癌癥干細(xì)胞的性質(zhì)，將有助于研發(fā)針對癌癥干細(xì)胞或同時針對其他癌癥細(xì)胞的有效治療方案[37]。這些研究表明，PDX 模型有利于加速藥物開發(fā)的研究，也易于將患者衍生的癌癥模型轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，從而給予新的治療建議。

雖然PDX 模型具有保留原發(fā)腫瘤組織學(xué)和分子特征的優(yōu)勢，但該模型在臨床應(yīng)用方面的價值仍具有諸多不足。首先，PDX模型需要手術(shù)切除患者的腫瘤組織用于培養(yǎng)異種移植物，但部分癌癥患者并不接受任何腫瘤組織的手術(shù)切除術(shù)，且手術(shù)切除率因癌癥類型多樣而存在較大差異。較低的手術(shù)切除率不僅降低了患者腫瘤組織的獲取率，還增加了PDX 模型構(gòu)建的難度系數(shù)。其次，PDX模型的建立存在成本高、開發(fā)時間長(最多6個月)及移植率低的問題[38]。一般建立第1個PDX 模型通常需要4～5個月，而隨后的PDX 傳代仍需2～5周，如前列腺癌 PDX的生長速度較慢，需要數(shù)月才能生成模型[39]。通常為了增加移植成功率，會使用基質(zhì)凝膠培養(yǎng)腫瘤組織，還會在微室中進(jìn)行培養(yǎng)。這種由微室培養(yǎng)的方式與基質(zhì)凝膠的培養(yǎng)效果基本一致，且傳代周期顯著縮短。據(jù)報道，條件重編程(conditional reprogramming，CR)技術(shù)可持續(xù)擴(kuò)增細(xì)胞譜系，維持活檢中細(xì)胞的異質(zhì)性[40]。這種技術(shù)能夠在體外擴(kuò)增PDX 細(xì)胞或應(yīng)用于高通量藥物篩選試驗及體外操作，可減少動物使用數(shù)量、腫瘤組織的變異性和研究成本。CR 技術(shù)能潛在地彌補(bǔ)體內(nèi)PDX 模型的不足，并用于靶向治療的轉(zhuǎn)化性研究和開發(fā)。相對而言，CR 技術(shù)的發(fā)展速度更快，成本也較低。因此，CR 技術(shù)可作為體內(nèi)PDX 模型的一種快速、低成本的替代方案。再次，雖然PDX 模型多選擇腎包膜下移植或原位移植方式，但這2種移植方法的操作難度系數(shù)較高，通常需要影像學(xué)檢測技術(shù)的輔助。最后，PDX模型常選用免疫缺陷小鼠為實驗動物，以保持原發(fā)腫瘤組織的異質(zhì)性，但由于宿主小鼠缺乏人體特定的免疫系統(tǒng)，使得該模型在免疫反應(yīng)研究中存在一定程度的局限性。

總之，PDX 模型已被證明是一種具有高度預(yù)測能力的實驗工具，可用于測試標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療后的治療效果和識別受益于臨床試驗中新療法的腫瘤類型。PDX模型是通過把個體患者的腫瘤組織移植到免疫功能低下的動物如嚴(yán)重免疫缺陷小鼠或裸鼠的體內(nèi)而形成，所以該模型的異種移植物仍保留了原始腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)志。因此，PDX 模型再現(xiàn)了原發(fā)疾病的生物學(xué)特征，適用于評估單個患者的癌癥化學(xué)治療敏感性，為癌癥治療領(lǐng)域提供了一個潛在研究工具。

4 結(jié)語

越來越多的研究表明，膀胱癌PDX模型在藥物篩選、生物標(biāo)志物開發(fā)和聯(lián)合臨床試驗等方面具有一定優(yōu)勢，但由于其免疫系統(tǒng)缺乏、移植成功率低、建模成本昂貴及時間較長等原因，使得PDX模型的應(yīng)用具有局限性。盡管如此，膀胱癌PDX模型這一類癌癥臨床前模型對于臨床治療領(lǐng)域的研究仍然是至關(guān)重要的。因此，人們需要對PDX模型的研究進(jìn)行不斷的完善與改進(jìn)，從而推動其更好地發(fā)展。