利用流式細(xì)胞儀對(duì)獼猴桃種質(zhì)染色體倍性的鑒定

羅 慶， 高建有， 李潔維， 葉開(kāi)玉， 莫權(quán)輝， 蔣橋生， 查滿榮， 王發(fā)明， 劉世彪

(1. 吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 吉首 416000；2. 廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所， 桂林 541006)

獼猴桃為大型木質(zhì)藤本植物隸屬獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，按照最新分類修訂，全球約有獼猴桃屬54種，21個(gè)變種，共約75個(gè)分類單元，中國(guó)是獼猴桃的中心分布區(qū)，有52種，其中44個(gè)為特有種[1]。獼猴桃富含維生素C，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高兼有抗癌等藥用和保健功效[2]，深受消費(fèi)者青睞，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)前景。

獼猴桃屬植物的倍性變異十分豐富，在自然界中主要以二倍體(2n=2X=58)、四倍體、六倍體的形式出現(xiàn)，已確定獼猴桃屬的染色體基數(shù)為29，且染色體較小，少有單倍體形式出現(xiàn)[3]，豐富的倍性水平為獼猴桃的遺傳改良提供了優(yōu)質(zhì)資源[4]，為新品種、新種質(zhì)的選育和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。目前獼猴桃主要的栽培品種為中華獼猴桃原變種(A.chinensisvar.chinensis)和美味獼猴桃變種(A.chinensisvar.deliciosa)，大部分都是通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種和實(shí)生選種而來(lái)[5]，而雜交育種的前提是了解親本的染色體倍性，以防止后代產(chǎn)生不育等現(xiàn)象，還有助于選育出品質(zhì)優(yōu)異、植株抗逆性強(qiáng)的新品種[6]，且有研究表明，染色體倍性與獼猴桃坐果率[7]、果實(shí)性狀[8]、種子質(zhì)量[9]等多個(gè)性狀緊密相關(guān)，而獼猴桃果實(shí)性狀的表現(xiàn)差異為品種改良和育種提供了遺傳資源和可能性，因此倍性研究對(duì)獼猴桃的發(fā)展十分重要，是獼猴桃育種實(shí)踐的重要環(huán)節(jié)。

目前鑒定獼猴桃染色體倍性的方法主要是染色體壓片法和流式細(xì)胞儀法，前者可直接觀察染色體，但操作耗時(shí)且不適宜進(jìn)行大規(guī)模的倍性鑒定[10]，而流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)具有檢測(cè)快、采集數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于生物學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域[11]。黃宏文等[3]與廖光聯(lián)等[6]報(bào)道了部分獼猴桃物種和品種(系)的染色體倍性，但由于獼猴桃種質(zhì)資源豐富、分布較為分散等原因，仍有部分種質(zhì)資源的倍性未知，導(dǎo)致獼猴桃倍性研究尚不完整[12]，不利于獼猴桃種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用。為確定我們所收集的不同獼猴桃種質(zhì)的染色體倍性，利用流式細(xì)胞儀對(duì)廣西植物研究所(桂林)獼猴桃種質(zhì)資源圃的11個(gè)物種，其中包括9個(gè)野生種類共50份獼猴桃種質(zhì)材料進(jìn)行了倍性鑒定，并探討了染色體倍性與果實(shí)性狀(果重、果毛類型和果肉顏色)之間的關(guān)系，以期為獼猴桃的育種和新品種開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

50份材料均于2020年7月上旬采自中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所獼猴桃種質(zhì)資源圃(桂林)，物種及品種(系)如表1所示。

表1 34份獼猴桃的染色體倍性水平與果實(shí)性狀

1.1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD FACSCalibur)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Thermo Primo R)、離心管等。解離液：0.246 g 10 mmol/L MgSO4·7H2O，0.373 g 50 mmol/L KCL，0.083 g 5 mmol/L HEPES，2 g 2% PVP-30，300 μL 0.3% Triton X-100，蒸餾水定容至100 mL，再調(diào)節(jié)pH值至7.5，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)參照施春暉等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，于上午9：00—11：00采取新鮮的獼猴桃莖尖嫩葉，將約0.2 g嫩葉去除主葉脈后放入培養(yǎng)皿中，滴入2 mL解離液并用刀片快速切碎，全過(guò)程需在冰上完成。充分切碎后用400目尼龍過(guò)濾布過(guò)濾至1.5 mL離心管中，過(guò)濾2次，然后放入4 ℃冰箱中5 min。取出濾液加解離液至1 mL刻度并離心，1 000 r/min，4 ℃，5 min，棄上清液后按上述操作再離心1次。離心管中預(yù)留約0.5 mL細(xì)胞液，加入80 μL PI染料于4 ℃冰箱中染色15 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)

以二倍體‘紅陽(yáng)’為對(duì)照組，流式細(xì)胞儀設(shè)置收集有效顆粒數(shù)為10 000，其中二倍體、四倍體和六倍體的熒光強(qiáng)度值呈倍數(shù)遞增，出峰效果如圖1所示，其中二倍體‘紅陽(yáng)’和‘華特’在橫坐標(biāo)熒光通道值為200時(shí)有峰值出現(xiàn)，四倍體‘金圓’和六倍體‘和平1號(hào)’分別在熒光通道值為400和600時(shí)有峰值出現(xiàn)，峰值出現(xiàn)與染色體倍性關(guān)系準(zhǔn)確，證明實(shí)驗(yàn)參數(shù)可靠，后續(xù)實(shí)驗(yàn)即以此進(jìn)行。不同獼猴桃種質(zhì)資源的倍性見(jiàn)圖2。

圖1 部分倍性獼猴桃的出峰圖Figure 1 Peak plot of different chromosome ploidy of kiwifruit

2.2 不同獼猴桃種質(zhì)資源的染色體倍性水平與果實(shí)性狀

利用流式細(xì)胞儀對(duì)50份獼猴桃種質(zhì)的染色體倍性檢測(cè)結(jié)果與果實(shí)性狀如表1、表2所示。

2.3 首次鑒定的獼猴桃種質(zhì)資源倍性與果實(shí)性狀

由表2可知，共有16份種質(zhì)的染色體倍性為首次鑒定，二倍體9份，四倍體3份，六倍體4份，其中中華獼猴桃共5種，均為二倍體，果肉顏色豐富，分為黃色、綠色和紅色；美味獼猴桃6種，四倍體2份，六倍體4份，除湘吉果肉顏色略黃，其余為綠色果肉；野生種類5種，4份為二倍體，1份四倍體。由于部分種的果實(shí)成熟較晚等原因，導(dǎo)致表2中數(shù)據(jù)收集不完全，有待進(jìn)一步收集研究。

表2 16份獼猴桃的染色體倍性水平與果實(shí)性狀

2.4 獼猴桃染色體倍性與果實(shí)主要性狀的相關(guān)性

由表1與表2可知，在所檢測(cè)的50份獼猴桃種質(zhì)中，二倍體獼猴桃共19份，四倍體13份，六倍體18份。中華獼猴桃主要以二倍體和四倍體為主，未見(jiàn)高倍體，果實(shí)略小，果毛主要為短茸毛或光滑無(wú)毛；美味獼猴桃主要以六倍體為主，低倍體較少，果實(shí)較大，果肉多為綠色，多被長(zhǎng)茸毛；野生種類中二倍體較多，無(wú)六倍體出現(xiàn)，果實(shí)普遍偏小，主要分為黃色和綠色果肉，果面一般光滑無(wú)毛。

研究比照了獼猴桃染色體倍性與果實(shí)主要性狀的關(guān)系，結(jié)果表明染色體倍性高低與果實(shí)性狀具有較明顯的相關(guān)性，并且基本符合前人報(bào)道的規(guī)律[14]。在倍性與果肉顏色方面，低倍性的二倍體和四倍體果肉顏色主要為紅色或黃色，如中華獼猴桃中的‘紅陽(yáng)’‘東紅’和‘豐悅’，也有少部分二倍體是綠色果肉，如野生的革葉獼猴桃及其變種，而六倍體多為綠色果肉，如美味獼猴桃中的和平系列。獼猴桃果毛類型差異較大，低倍性的二倍體和四倍體果面多被短茸毛或光滑無(wú)毛，如中華獼猴桃中的‘紅昇’和‘楚紅’，而六倍體果面一般密被長(zhǎng)茸毛或硬毛，如美味獼猴桃中常見(jiàn)的‘金魁’和‘海沃德’。果實(shí)重量方面，低倍體果實(shí)重量總體上低于高倍體，如二倍體和四倍體的中華獼猴桃果重一般在80 g左右，少有100 g以上的品種出現(xiàn)，而六倍體的美味獼猴桃果重一般在90 g左右，且100 g以上的品種較多，如‘金碩’‘皖翠’等。值得注意的是，‘楚紅’為早熟品種，雖為四倍體，但其果實(shí)較小，這可能與其成熟期較早有關(guān)；美味獼猴桃中的‘湘吉’為少籽至無(wú)籽類型，所以重量較輕；毛花獼猴桃中的‘華特’是通過(guò)野生優(yōu)株中選育出的大果品種，所以果實(shí)略大。

3 討論

獼猴桃葉中含有較多的糖和黏性物質(zhì)，對(duì)儀器造成了不同程度的堵管現(xiàn)象，鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)濾液的顏色與其黏性程度有較大關(guān)聯(lián)，濾液顏色越深，堵管越嚴(yán)重，收集速度越慢，所以在選取對(duì)照組時(shí)，應(yīng)選取濾液顏色較淡且倍性已知的品種，野生種類的出峰效果最好且收集速度最快。

雜交育種和高倍體誘導(dǎo)育種是獼猴桃的重要育種方式。雜交育種可以重新組合親本的基因，獲得親本的優(yōu)良性狀，從而產(chǎn)生變異新植株[15]，還能產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，獲得比親本更好的表現(xiàn)性。通過(guò)雜交育種已培育出了一些優(yōu)良品系，如以美味獼猴桃和中華獼猴桃‘紅陽(yáng)’雜交選育出的新品種‘紅華’，改善了‘紅陽(yáng)’果實(shí)偏小的性狀[16]。常見(jiàn)的高倍體誘導(dǎo)育種方式有秋水仙素法、輻射誘變和多倍體誘導(dǎo)融合技術(shù)等[17]，Liu等[18]利用秋水仙素處理四倍體的軟棗獼猴桃葉片組織，成功獲得了八倍體植株。染色體多倍化是獼猴桃的重要生物學(xué)特征，染色體組增加而產(chǎn)生的多倍化是高等植物染色體進(jìn)化的顯著特征，多倍體植物的遺傳和形態(tài)多樣性更加豐富，并且適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的能力也更強(qiáng)[19]，高倍體獼猴桃的果實(shí)在耐貯性、抗逆性和增大果等方面都具有顯著優(yōu)勢(shì)[20]。就該文材料而言，中華獼猴桃主要以低倍體為主，16個(gè)品種中共9個(gè)二倍體7個(gè)四倍體，如果通過(guò)人工誘導(dǎo)提高其倍性水平則可以促進(jìn)其性狀改良，可能增強(qiáng)植株抗病能力，延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期，增加果實(shí)質(zhì)量和畝產(chǎn)量。美味獼猴桃的倍性水平較高，在20個(gè)品種中共有18個(gè)六倍體，如果通過(guò)倍性育種改變其倍性，可能產(chǎn)出更大類型的果實(shí)，且其果實(shí)成熟期比較晚，一定程度上有錯(cuò)開(kāi)市場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)，帶來(lái)更高的市場(chǎng)收益。野生種類的獼猴桃果實(shí)表現(xiàn)不突出，倍性主要以低倍性的二倍體為主，但其長(zhǎng)期在自然狀態(tài)下生長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)且具有抗逆基因，種質(zhì)資源也十分豐富，這為新品種的改良和選育提供了重要的基礎(chǔ)資源，同時(shí)也是栽培品種果實(shí)品質(zhì)和抗逆性改良的重要手段[21]。

倍性是影響獼猴桃果實(shí)性狀表現(xiàn)的重要因素之一，倍性研究對(duì)獼猴桃的市場(chǎng)有重要的指導(dǎo)意義。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)高倍體獼猴桃果肉一般為綠色、重量大于低倍體品種、且多被硬糙毛；低倍體果肉一般為黃色、一般被少絨毛。果毛可以使果實(shí)免受機(jī)械損傷和抵御一些蟲(chóng)害，在一定程度上是抗性增強(qiáng)的表現(xiàn)，且高倍體獼猴桃植株的藤蔓更粗壯，抗倒伏、抗病蟲(chóng)害等抗逆性更強(qiáng)，這對(duì)提高獼猴桃產(chǎn)量和擴(kuò)大種植面積有利[22]，所以高倍體能更好地滿足市場(chǎng)的需求[23]。研究發(fā)現(xiàn)，中華獼猴桃中的低倍體品種‘皖金’為黃色果肉，果毛較少且為絨毛，果重方面表現(xiàn)突出，平均果重達(dá)133 g，比一般六倍體果實(shí)更重，這可以作為重點(diǎn)品種加以研究和管培，以便進(jìn)入高端獼猴桃市場(chǎng)。該研究50份獼猴桃材料的倍性均未出現(xiàn)單倍體形式，與先前報(bào)道結(jié)果[3,6]基本一致，該文新增了16份獼猴桃材料的倍性資料，很多種類都蘊(yùn)藏著優(yōu)質(zhì)的性狀?！セ?號(hào)’極耐儲(chǔ)藏，自然條件下可存放2個(gè)月，這對(duì)運(yùn)輸和擴(kuò)大市場(chǎng)范圍有利；野生種類中的‘奶果’為常綠種，具有重要的開(kāi)發(fā)和育種價(jià)值。研究豐富了獼猴桃種質(zhì)倍性資源庫(kù)，為獼猴桃新品種開(kāi)發(fā)和系統(tǒng)發(fā)育提供生物學(xué)資料。

4 結(jié)論

栽培品種中華和美味獼猴桃的倍性水平比較豐富，中華獼猴桃以二倍體和四倍體占多數(shù)，果肉顏色多為紅色或黃色，果面多被茸毛或光滑無(wú)毛；美味獼猴桃以六倍體居多，果肉一般為綠色，多被長(zhǎng)茸毛。其他物種多為二倍體，綠色果肉，短茸毛至無(wú)毛，所有種質(zhì)均未出現(xiàn)單倍體形式。