小腸結腸炎耶爾森菌非特異性核酸酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

朱 瑜， 郭森林， 高 婷， 王 輅， 李端華， 李進軍， 葛 燕， 趙 晨

(成都大學 藥學院 四川抗菌素工業(yè)研究所， 成都 610106)

非特異性核酸酶(non-specific nuclease)是一類可非特異性降解單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋等幾乎所有形式的核酸酶[1]，被廣泛應用于多個領域。在分子生物學研究中非特異性核酸酶可用于核酸結構測定和DNA修復，DNA、RNA的復制與重組，抗病毒試劑的應用等；醫(yī)藥方面，可用于疾病的診斷和治療，如腫瘤、纖維性囊腫、紅斑性狼瘡、兒童急性氣喘等；工業(yè)上主要應用于生物制品中外源核酸的去除[2]，減少過敏反應，提高產品安全性。

來源于小腸結腸炎耶爾森菌的非特異性核酸酶(non-specific nuclease fromYersiniaenterocoliticasubsp.Palearctica,Nucyep)熱穩(wěn)定性好[3]，80 ℃水浴2 h仍有60%左右的殘余酶活，優(yōu)異的熱穩(wěn)定性增加了其應用的廣泛性。目前，重組Nucyep多使用大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)表達系統(tǒng)進行表達。Boissinot[3]、Fang[4]等在大腸桿菌中成功表達重組Nucyep，但條件優(yōu)化后仍產量較低；本實驗室前期研究[5]對Nucyep基因進行密碼子優(yōu)化并克隆至E.coli，表達量有明顯提高，但與絕大多數(shù)外源基因類似，Nucyep基因在E.coli系統(tǒng)中易形成包涵體[6]，復性步驟復雜，且存在復性收率低、蛋白活性差等問題，為下游純化及進一步應用帶來限制。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)作為公認的安全菌株(generally recognized as safe，GRAS)，具有蛋白分泌能力強、易于高密度發(fā)酵、遺傳背景清晰等優(yōu)勢，是異源蛋白分泌表達的理想宿主[7]。信號肽(signal peptide,SP)作為一種重要的蛋白分泌調控元件，是一段存在于前體蛋白N-端的短肽鏈，其功能在于引導和調節(jié)前體蛋白的折疊，在蛋白轉移和分泌過程中發(fā)揮極其重要的作用[8]。B.subtilis缺乏外膜結構，分泌蛋白會轉運到胞外培養(yǎng)基中，保證分泌蛋白的正確定位和轉移則由信號肽來完成[9]。鑒于Nucyep在E.coli表達系統(tǒng)中重組表達后提取復雜的問題，本研究擬采用B.subtilis表達系統(tǒng)進行Nucyep的分泌表達，以期達到簡化下游處理的目的。通過無縫克隆方法將來源于B.subtilis基因組的信號肽DNA混合物隨機構建至Nucyep基因的5′端得到重組表達載體，對信號肽進行篩選得到分泌水平最高的菌株。然后對該工程菌進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，探究重組菌的表達條件對產酶的影響，確定最適培養(yǎng)條件，為該酶的基礎研究及未來應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及材料

硫酸卡那霉素、氨芐青霉素鈉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性核酸內切酶NdeI和XhoI購自Thermo fisher公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit等試劑盒購自BioTek公司；限制性核酸內切酶MluI和Eco52 I、DNA Ligation Kit、B.subtilisSecretory Protein Expression System試劑盒購自Takara公司；DNA Marker Ⅳ購自天根生化科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自OXOID公司；葡萄糖及其他無機鹽等均購自成都科龍化工有限公司；Millipore超濾離心管(10 ku)購自Merck公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

1×LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化鈉10；3×LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨30、酵母提取物15、氯化鈉30；2×YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16、酵母提取物10、氯化鈉5(pH 7.0)；2×LM培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20、酵母提取物10、氯化鈉10、一水合麥芽糖75、七水合硫酸鎂2。

1.1.3 菌株及質粒

本研究所用菌株和質粒均為本實驗室購買和保存，詳見表1。

表1 本研究所用的菌株和質粒

1.2 方法

1.2.1 載體pBE-S-nucyep構建及驗證

分別擴增提取實驗室前期已成功構建的重組表達載體pET24a-nucyep[5]及pBE-S，使用NdeI和XhoI雙酶切，1%瓊脂糖驗證正確后，按Gel Extraction Kit說明書操作，膠回收得到目的片段nucyep及線性載體pBE-S。按DNA Ligation Kit說明書操作，將二者于16 ℃連接過夜獲得pBE-S-nucyep。連接產物轉化E.coliTop10感受態(tài)細胞(轉化及感受態(tài)制備方法見文獻[10])，抗性篩選陽性克隆，擴增提取質粒雙酶切驗證并委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司(下稱“北京擎科”)測序，將測序正確的質粒及菌種-20 ℃保存。

1.2.2 分泌表達載體pBE-S-nucyep-SPs的構建

以MluI和Eco52 I雙酶切質粒pBE-S-nucyep得到線性化的pBE-S-nucyep，然后使用In-Fusion?HD Cloning Enzyme(無縫克隆酶)將線性化pBE-S-nucyep與帶有15 bp重疊末端的B.subtilis信號肽DNA混合物(Takara公司B.subtilisSecretory Protein Expression System試劑盒提供)于50 ℃下溫育15 min進行連接。將連接產物轉化至E.coliStellar感受態(tài)細胞，涂布帶抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)過夜，得到陽性轉化子。將E.coli轉化子分別擴增提取質粒DNA，委托北京擎科進行測序，與試劑盒提供的信號肽DNA序列進行比對，將序列正確的質粒pBE-S-nucyep-SPs(SPs代表不同的信號肽DNA)及菌種分別于-20 ℃保存。

1.2.3 高分泌水平工程菌的構建及篩選

為防止含有相同信號肽的克隆被重復篩選，將上述含有不同信號肽DNA序列的載體pBE-S-nucyep-SPs分別轉化B.subtilisRIK1285，得到帶有不同信號肽DNA的重組工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-SPs。將上述各株重組工程菌分別接種LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。再將過夜種子液以體積分數(shù)5%接種量接種，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，培養(yǎng)液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集培養(yǎng)上清液作為粗酶液直接用于活性檢測，由此獲得Nucyep分泌活性最高的重組工程菌。

1.2.4 重組Nucyep的分泌表達條件初步優(yōu)化

將篩選得到的分泌表達水平最高的菌株作為出發(fā)菌株，過夜種子液以體積分數(shù)5%接種量接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)表達至48 h并以此為對照進行條件優(yōu)化。首先對不同培養(yǎng)基條件下Nucyep的分泌表達水平進行考察，選擇1×LB、3×LB、2×LM、2×YT等4種不同培養(yǎng)基，取發(fā)酵上清液進行活性檢測，選取最優(yōu)分泌表達培養(yǎng)基。在此基礎上，對重組工程菌的不同培養(yǎng)條件進行探討，包括培養(yǎng)總時長(24、36、48、60 和72 h)，培養(yǎng)溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃)，培養(yǎng)基初始pH值(6.1、6.9、7.5、8.0)，轉速(120、140、160、180、200、220 r/min)。以B.subtilisRIK1285作為陰性對照菌株。

運用Excel軟件數(shù)據(jù)分析模塊單因素方差分析[11]對優(yōu)化結果進行統(tǒng)計學分析，同時對4種因素不同水平間對Nucyep分泌表達的影響結果進行t檢驗判斷其差異程度，檢驗水準α=0.05。

1.2.5 粗酶液的濃縮及SDS-PAGE分析

培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液，用Millipore超濾離心管50 mL/10 ku超濾濃縮并做脫鹽處理。取40 μL上述濃縮上清液，加入5×上樣緩沖液10 μL進行煮沸制樣。以實驗室前期純化酶Nucyep為陽性對照品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色并脫色，對電泳結果進行分析。

1.2.6 重組Nucyep的活性測定

采用比光密度法對重組Nucyep進行活性檢測。反應體系為36 μL 0.1 μg/μL鮭魚精子DNA底物溶液(20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.23)，加入2 μL發(fā)酵上清液混合均勻，即開啟反應。反應溫度37 ℃，反應時間4 min，加入反應終止液并立即冰浴以終止酶反應[12]。取10 μL反應混合物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用Biorad公司Quantity One(Ver.4.6.6)軟件分析各條帶，記錄光密度值。在上述條件下，酶活單位定義為在37 ℃，pH 7.23的條件下，38 μL的體系中以濃度為0.1 μg/μL的核酸為底物，每分鐘使核酸的比光密度值減少1%的酶量定義為1個活性單位(Unit)。

2 結果與分析

2.1 載體pBE-S-nucyep的構建及驗證

如圖1所示，目的基因nucyep長度為792 bp，對重組載體pBE-S-nucyep雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見800 bp左右出現(xiàn)目的條帶，大小與預期一致，表明pBE-S-nucyep成功構建。

M：Marker IV；1：未酶切質粒pBE-S-nucyep；2：Nde I單酶切質粒pBE-S-nucyep；3：Nde I，Xho I雙酶切質粒pBE-S-nucyep。圖1 重組載體pBE-S-nucyep雙酶切驗證結果Figure 1 The double digestion results of plasmid pBE-S-nucyep

2.2 高分泌水平工程菌的構建及篩選

將線性化pBE-S-nucyep與信號肽DNA混合物進行無縫克隆，連接產物轉化E.coliStellar感受態(tài)細胞并涂布于LB抗性平板，獲得53個陽性轉化子。擴增提取所有陽性轉化子的質粒DNA并測序(包括基因5′端信號肽序列及nucyep基因序列)，經比對后共得到43個正確質粒。將上述帶不同信號肽的質粒DNA分別轉化B.subtilisRIK1285，挑取陽性克隆并進行培養(yǎng)表達，對培養(yǎng)上清液進行Nucyep活性檢測。含有不同信號肽重組菌的活性測定結果如圖2所示，這表明大部分信號肽都能促進重組酶的分泌表達，且不同信號肽對Nucyep分泌表達的促進作用差異明顯。其中，攜帶有信號肽YoaW的轉化子活性最高，光密度下降值達到44.4%。分別對促進分泌表達作用最高的4種信號肽及最低的2種信號肽序列進行分析，結果如表2所示。其中，攜帶信號肽YoaW、AprE、XynA、Pbp的4個轉化子重組Nucyep的分泌表達活性最高，光密度下降值均達到40%以上，而少數(shù)如攜帶信號肽citH、yjiA轉化子的發(fā)酵上清液中幾乎未檢測到重組Nucyep的分泌表達活性(光密度下降值<1%)，再次說明不同信號肽對Nucyep的分泌效率差異明顯。

圖2 43株陽性克隆的活性檢測Figure 2 Activity assay of 43 positive clones

表2 高Nucyep活性克隆的信號肽序列

2.3 重組工程菌分泌表達條件初步優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)基對Nucyep分泌表達水平的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基在微生物的生長過程中普遍發(fā)揮著重要作用，而其各成分添加量則對微生物合成蛋白質及產酶有重要影響。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝可以充分利用菌株潛力，提高發(fā)酵的生產效率，降低生產成本。選取上述分泌水平最高的菌株B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-YoaW作為起始菌株進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。將重組菌在1×LB、3×LB、2×LM、2×YT等4種不同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后離心取上清液進行Nucyep酶活測定，結果如圖3所示。3×LB培養(yǎng)基對重組Nucyep的分泌表達效果最好，酶活達到(4.10±0.03) U/μL，約為1×LB培養(yǎng)基中的10倍，且顯著高于2×LM、2×YT培養(yǎng)基，說明高含量的碳氮源對重組Nucyep的合成與釋放具有顯著的促進作用，故選取3×LB為最適培養(yǎng)基，并將其應用于后續(xù)培養(yǎng)條件研究。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 不同培養(yǎng)基對重組Nucyep酶活的影響Figure 3 Effects of culture media on recombinant Nucyep activity

2.3.2 培養(yǎng)時間對Nucyep酶活的影響

對不同培養(yǎng)時長下的Nucyep活性檢測結果如圖4所示，當培養(yǎng)時間從24 h至48 h時，B.subtilisRIK1285產酶呈現(xiàn)上升的趨勢，酶活由(2.66±0.33) U/μL升高至(4.42±0.43) U/μL，達到最高，這與Irfan等[13]的研究中重組酶的最佳培養(yǎng)時長一致，最高點均出現(xiàn)在48 h。當持續(xù)發(fā)酵至58 h和72 h時，粗酶液中Nucyep酶活力分別下降至(1.84±0.22) U/μL和(2.95±0.55) U/μL。這可能是由于B.subtilisRIK1285存在分泌至胞外的多種蛋白酶對重組Nucyep具有一定降解作用，導致該階段活性下降。對不同培養(yǎng)時間下Nucyep酶活測定結果進行單因素方差分析，得到P<0.01，表明不同培養(yǎng)時間對酶活的影響差異極顯著。綜上，選擇48 h為最佳培養(yǎng)時間。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 不同培養(yǎng)時間下重組Nucyep酶活Figure 4 Effects of incubation time on recombinant Nucyep activity

2.3.3 培養(yǎng)溫度對重組Nucyep酶活的影響

溫度主要從發(fā)酵動力學特性、菌體代謝產物合成、微生物代謝調節(jié)機制、發(fā)酵液的理化性質等方面影響產物的合成，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度。B.subtilis最佳生長溫度為25 ℃～37 ℃[14]，且已有不少報道[15-17]對B.subtilis表達異源蛋白進行了研究，其中常用的培養(yǎng)溫度范圍為30 ℃～37 ℃。研究探討培養(yǎng)溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃和37 ℃時重組Nucyep的胞外活性。結果如圖5所示，當溫度由25 ℃升高至30 ℃時，酶活呈現(xiàn)上升趨勢，且在30 ℃時重組Nucyep活性最高，達到(6.71±0.23) U/μL。當培養(yǎng)溫度上升至35 ℃及37 ℃時，酶活水平分別出現(xiàn)不同程度的降低，為(2.57±0.70) U/μL和(4.42±0.43) U/μL。對不同溫度下的酶活水平進行單因素方差分析，得到P<0.01，表明差異極顯著，說明溫度對Nucyep的分泌活性具有較大影響。因此，選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 不同培養(yǎng)溫度對重組Nucyep酶活的影響Figure 5 Effects of incubation temperature on recombinant Nucyep activity

2.3.4 轉速、培養(yǎng)基初始pH值對重組Nucyep酶活的影響

研究還探討了轉速對重組Nucyep酶活的影響。結果如圖6所示，在低轉速120和140 r/min時，培養(yǎng)上清液中Nucyep酶活性偏低，而將轉速繼續(xù)提高，酶活出現(xiàn)較大幅度提升，最高值出現(xiàn)于160 r/min處，酶活達到(6.04±0.44) U/μL。通過對數(shù)據(jù)的單因素方差分析，得到P=0.001 548<0.05，差異顯著。然而通過對160～220 r/min幾組不同轉速下的Nucyep酶活數(shù)據(jù)進行組間t檢驗結果表明，轉速在160、180和200 r/min時，3組數(shù)據(jù)組間差異不顯著，而180、200和220 r/min的各組間差異也不顯著，這說明在160～220 r/min轉速范圍內，轉速對Nucyep的分泌表達影響并不明顯。故研究最終仍選擇以不改變初始條件下的220 r/min為后續(xù)培養(yǎng)轉速。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差;不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 不同轉速對重組Nucyep酶活的影響Figure 6 Effects of rotation speed on recombinant Nucyep activity

微生物生長及生物合成都有其最適合的pH值范圍，不同芽孢桿菌在生理模式上的差異也導致其產酶的培養(yǎng)條件差別很大。研究表明，枯草芽孢桿菌在pH值為6.5至7.5的條件下生長良好[18]。研究將分別調整培養(yǎng)基初始pH值至6.1～8.0，最終獲得Nucyep的分泌活性結果如圖7所示，對其進行單因素方差分析結果P=0.020 929<0.05，差異顯著，說明培養(yǎng)基不同初始pH值對Nucyep的分泌表達具有一定影響。然而通過對培養(yǎng)基初始pH值下Nucyep酶活的數(shù)據(jù)進行組間t檢驗，結果表明培養(yǎng)基初始pH值6.1、6.9、7.5的組間差異均不顯著，酶活均處于4～5 U/μL，這說明培養(yǎng)基初始pH值在6.1～7.5重組Nucyep的分泌活性并未受到很大影響，而當初始pH值調整為8.0時，酶活下降為(3.74±0.43) U/μL，說明重組Nucyep在偏堿性條件下分泌表達受到抑制。Wang等[19]的研究也表明有時在培養(yǎng)過程中不對pH值加以調控反而更利于芽孢桿菌的產酶，結合本研究所得結果，同時考慮到簡化實驗操作，故最終選擇以培養(yǎng)基自然pH條件(約為6.8～6.9)為最適培養(yǎng)基初始pH值。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同初始pH值對重組Nucyep酶活的影響Figure 7 Effects of pH on recombinant Nucyep activity

綜上，重組工程菌培養(yǎng)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為3×LB培養(yǎng)基，體積分數(shù)5%接種量，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

2.4 發(fā)酵優(yōu)化結果驗證

根據(jù)上述各個因素的優(yōu)化結果，對該培養(yǎng)條件進行驗證，培養(yǎng)結束后對粗酶液進行活性測定，結果如圖8所示，優(yōu)化后Nucyep酶活性具有顯著提高，達到(8.27±0.41) U/μL，較優(yōu)化前提高約20倍。用10 ku的超濾管對粗酶液進行濃縮約20倍并進行脫鹽處理，然后進行酶活測定，反應混合物凝膠電泳結果如圖9所示，核酸底物幾乎被完全降解。超濾濃縮液SDS-PAGE分析見圖10，在30 ku左右出現(xiàn)目的條帶，與理論值相符[5]。結果均表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下重組Nucyep的胞外分泌表達水平有明顯提高，且活性良好。

數(shù)值為3個平行實驗的平均值±標準差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 培養(yǎng)條件優(yōu)化前后的酶活測定Figure 8 Nucyep activity assay before and after optimization

3 討論

不同信號肽對目的蛋白的分泌效率差異明顯，雖然目前還未發(fā)現(xiàn)目的蛋白與其自身最優(yōu)信號肽之間存在一定特性與規(guī)律，但通過對宿主菌信號肽篩選仍是一種有效提高目的蛋白分泌表達的方法。Zhang等[20]建立了信號肽篩選系統(tǒng)，篩選木聚糖酶在B.subtilis中的最適信號肽，通過對Sec途徑的114種信號肽和Tac途徑的24種信號肽進行篩選，發(fā)現(xiàn)Sec途徑比Tac途徑信號肽更利于木聚糖酶的表達，其中信號肽PhoB為最佳信號肽。Yao等[21]通過高通量篩選系統(tǒng)對B.subtilis信號肽進行篩選，最終獲得3種對α-淀粉酶分泌效率提高的信號肽，分泌能力YojL>RpmG>AspB，信號肽YojL使重組酶活提高了3.5倍。

1：NC為陰性對照；2～4：優(yōu)化前；5～7：優(yōu)化后；8～10：超濾外液。圖9 活性測定反應產物的電泳結果Figure 9 Electrophoresis results of reaction mixture

M: Marker；C: 對照品；1: 濃縮液。圖10 濃縮液SDS-PAGEFigure 10 The SDS-PAGE analysis of concentrated supernatant

研究通過無縫克隆法將B.subtilis信號肽DNA混合物構建入Nucyep表達載體，最終獲得含有43種不同信號肽的陽性克隆。通過對43株重組工程菌的篩選得到具有高分泌活性的4株，分別含有信號肽YoaW、AprE、XynA、Pbp，對這4株高活性工程菌的信號肽序列及其他信號肽的序列比對分析，可發(fā)現(xiàn)信號肽的二級結構與其促分泌性能相關：信號肽N端帶正電荷氨基酸數(shù)量為2或3，H端結構域的非極性氨基酸越多，對重組Nucyep的分泌表達有促進作用，這與B.subtilis信號肽相關研究[22-24]結論一致，但具體原因仍待進一步研究。因此應進一步加強對信號肽的基礎研究及應用，充分了解每種途徑中各信號肽的分泌機制及相互作用及其影響因素，為未來枯草芽孢桿菌的高效工業(yè)應用提供條件。

研究通過構建并篩選B.subtilis信號肽重組工程菌，實現(xiàn)了Nucyep的胞外分泌表達，并通過對培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化進一步提高了Nucyep的胞外分泌活性。優(yōu)化后，重組Nucyep分泌活性雖然較初始條件有顯著提高，但通過SDS-PAGE不難發(fā)現(xiàn)，其蛋白表達水平仍然偏低。這可能因為Nucyep幾乎能降解一切形式的核酸，對機體來說屬于毒性蛋白，且在B.subtilis中直接以具有活性的形式分泌表達，機體出于自我保護而限制了其表達水平，同時也可能是B.subtilis系統(tǒng)分泌蛋白酶較多而導致胞外分泌蛋白表達量低。蛋白酶基因缺陷菌株B.subtilisWB800、WB600等[25]的開發(fā)與應用可將胞外蛋白酶活性降至野生型活性的0.32%，從而提高外源基因的表達，因此后續(xù)可嘗試敲除蛋白酶的B.subtilis菌株作為表達宿主。鑒于目前還未有利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)重組表達非特異性核酸酶的研究，無法對Nucyep在B.subtilis系統(tǒng)中的表達水平進行比較。但通過與實驗室前期在E.coli中表達Nucyep的研究相比較[5]，B.subtilisRIK1285培養(yǎng)上清液在濃縮約20倍的情況下，才能達到與E.coli胞內表達大致相當?shù)乃?SDS-PAGE)。此外，由于Nucyep為毒性蛋白，在E.coli中以包涵體形式而非可溶形式表達，這也一定程度上有利其表達水平的提高，而研究旨在利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)良好的分泌性能及通過信號肽篩選以實現(xiàn)Nucyep的高活性分泌表達。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，結果表明雖然單因素實驗方法簡單易行，結果表現(xiàn)直觀，但存在一定弊端，如多因素考察時間長，實驗次數(shù)多、成本高，且會割斷因素之間的相互影響等。因此，將研究單因素實驗優(yōu)化結果作為基礎條件，后期可選擇統(tǒng)計學優(yōu)化法，如Plackett-Burman設計法[26]、響應面方法[4]等對培養(yǎng)條件進行進一步優(yōu)化，以獲得更高的表達水平。

4 結論

研究首次將Nucyep的基因構建進B.subtilis表達系統(tǒng)，篩選信號肽得到工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-S-nucyep-YoaW，實現(xiàn)Nucyep的高活性分泌表達。經表達條件優(yōu)化，該工程菌在3×LB培養(yǎng)基中以體積分數(shù)5%接種量，30 ℃，搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，重組Nucyep酶活達到(8.27±0.41) U/μL，較優(yōu)化前提高20倍，為其進一步應用奠定基礎。